磁刺激对小鼠原代海马神经元突触形态、突触蛋白及bdnf-trkb信号通路表达的影响

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1、河北医科大学博士学位论文磁刺激对小鼠原代海马神经元突触形态、突触蛋白及BDNF--TrkB信号通路表达的影响姓名：马隽申请学位级别：博士专业：人体解剖与组织胚胎学指导教师：崔慧先201204中文摘要维甲酸受体Gt在全反式维甲酸调节血管平滑肌细胞KLF4表达中的作用及机制研究摘要目的：Krnppel样因子4(Kmppel．1ikefactor4，KLF4)是一种含有锌指结构的转录因子，在多种组织和细胞中广泛存在。在不同细胞内环境中，KLF4作为一种基础转录因子，可激活或抑制多种基因的转录并调节包括增殖、分化、发育、炎症和凋亡在内的多种细胞生物学过程。因此，KLF4基因的表达调节和功能改变是影响

2、细胞生物学行为的重要因素之一。前期的研究表明，KLF4基因功能的调节是复杂的网络调节过程，既可以通过转录水平进行调节，又可以通过转录后翻译修饰水平调节，后者包括磷酸化、乙酰化、苏素化及泛素化等过程的调节。此外，大量实验证据表明，多种刺激因素均可影响细胞内KLF4的水平，如血清饥饿、氧化应激、血小板衍生生长因子．BB(platelet．derivedgrowthfactor-BB，PDGF．BB)、丁酸盐、环孢素、硒、转化生长因子p(transforminggrowthfactor-13，TGF．p)、干扰素小环腺苷酸(cyclicadenosinemonophosphate，cAMP)和全反

3、式维甲酸(all—transretinoicacid，ATRA)。本室前期研究发现，ATRA除可诱导KLF4表达外，还可以促进KLF4乙酰化和磷酸化修饰，进而转录激活血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecell，VSMC)分化标志基因SM22仅和SM0【．actin并促进VSMC向分化表型转化。此外，Owens等人发现转录因子激活蛋白，1(transcriptionfactorstimulatingprotein．1，Spl)参与VSMC中K1f4基因的转录调节；Yang等人报道KLF4可通过自调控方式调节Klf4基因转录。ATRA是膳食摄入维生素A的代谢产物，可通过结合

4、其胞内核受体RAR和RXR而直接调节下游靶基因转录并促进VSMC分化。RAR可与靶基因启动子区的维甲酸应答元件(retinoicacidresponseelement，RARE)直接结合而调控靶基因的转录。未结合配体的RAR往往与辅抑制子构成转录抑制复合体而使基因沉默；结合配体后，RAR募集一系列辅转录激活因子从而激活下游基因的转录。此外，RAR还可通过与其他转录因子结合而间接调节基因转录，如RAR可通过与转录因子Spl／Sp3或STAT5中文摘要结合而间接结合在启动子区的Spl／Sp3或STAT5结合位点发挥转录调控作用。目前，RAR被认为是治疗VSMC增殖性疾病的重要靶分子。在临床治疗中

5、，ATRA已经成功的运用于白血病、癌症及动脉再狭窄和斑块形成等疾病的治疗。然而，ATRA诱导Klf4基因表达的分子机制目前仍不十分清楚。本研究系统的探讨了VSMC中ATRA信号在诱导Klf4基因转录过程中的作用及其分子机制。方法：细胞培养，腺病毒及质粒载体的构建，定点突变，小干扰RNA转染，RNA提取及定量RT-PCR分析，Westem印迹分析，荧光素酶报告基因分析，染色质免疫共沉淀分析，寡核苷酸pull．down分析，GSTpull．down分析，免疫共沉淀分析，BrdU掺入分析，细胞迁移分析，鬼笔环肽细胞骨架染色等。结果：1RARa介导ATRA诱导的Klf4基因表达ATRA通过与其受体R

6、AR和RXR结合而发挥转录调节的作用。RAR有三种亚型：RARer、RARI)和RART，分别由不同的基因编码。本部分研究证实RARer，而不是RARl3或RARy，参与了ATRA诱导的Klf4基因表达。结果如下：1．1ATRA以浓度和时间依赖性方式诱导KLF4和RAR(I表达为了探讨ATRA诱导KLF4与ATRA受体(RARa、RARl3和RARv)表达之间的关系，我们首先应用Western印迹分析方法检测不同浓度ATRA刺激VSMC不同时间后，KLF4和三种RAR的表达水平。结果显示，ATRA可显著诱导KLF4和RAR(I的表达，且呈剂量和时间依赖性。然而，ATRA刺激后，RARl3和R

7、AIⅥ表达水平无显著变化。1．2RA_R0t介导ATRA诱导的Klf4基因表达为了进一步探寻介导ATRA诱导Klf4基因转录的核受体，我们应用小干扰RNA(si—RAR0t，si—RAR[3和si—RARv)分别敲低三种内源性RAR的表达。结果显示，在敲低内源性砒讯0【的细胞中，ATRA对Klf4表达的诱导作用受到显著抑制。用RAR(t选择性抑制剂Ro41．5253抑制RAR(I活性后再用ATRA刺激VSMC