在癫痫神经元中mir-132调控bdnf-trkb信号通路表达的研究

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1、分类号：R742.1学校代码：10062密级：学号：2012602695硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：在癫痫神经元中miR-132调控BDNF-TrkB信号通路表达的研究TITLE：StudyofmiR-132regulatesBDNF-TrkBsignalingexpressioninepilepticneurons一级学科：临床医学二级学科：神经病学论文作者：蔡浩指导教师：宋毅军主任医师天津医科大学研究生院二○一五年五月分类号：R742.1学校代码：10062密级：学号：2012602695学位类别：科学学位专业

2、学位学科门类：医学硕士学位论文MASTER’SDISSERTATION论文题目：在癫痫神经元中miR-132调控BDNF-TrkB信号通路表达的研究TITLE：StudyofmiR-132regulatesBDNF-TrkBsignalingexpressioninepilepticneurons一级学科：临床医学二级学科：神经病学论文作者：蔡浩指导教师：宋毅军主任医师天津医科大学研究生院二○一五年五月学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中

3、不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密√。（请在相对应的方框内打“√”）学位论文作者签名：日期：年月日导师签名：日期：年月日

4、天津医科大学硕士学位论文中文摘要目的：颞叶癫痫是最常见的癫痫类型，且绝大多数是药物难治性癫痫，其发病机制尚不十分清楚。脑源性神经营养因子(brainderivedneurotrophicfactor,BDNF)促进了神经元的存活、生长发育及分化等过程。其生物学功能主要通过特异性受体酪氨酸激酶B（tyrosinekinasereceptorB,TrkB）介导而实现。近来研究表明BDNF-TrkB信号通路在癫痫的发生与发展过程中起着关键作用。微小RNA(microRNA)是一种内源性非编码蛋白的小分子RNA。现已被证实其在多种神经系统疾病中发挥着重要功能

5、。研究发现miR-132在癫痫发病过程中发挥了重要作用，但具体机制有待研究。本课题旨在通过检测转染miR-132后的海马神经元癫痫模型中TrkB蛋白磷酸化水平的变化，来了解其对BDNF-TrkB信号通路的调控作用，并探讨其在癫痫发病中的作用。方法：制备miR-132慢病毒表达载体。采用24小时内新生SpragueDawley（SD）大鼠，取海马神经元体外原代培养7天。采用完全随机化方法将细胞分为①正常组、②癫痫组、③正常+BDNF组、④癫痫+BDNF组、⑤正常+miR-132组、⑥癫痫+miR-132组、⑦正常+BDNF+miR-132组、⑧癫痫+B

6、DNF+miR-132组。利用膜片钳技术检测海马神经元放电情况，荧光定量PCR法检测海马神经元中miR-132的表达情况，利用免疫印迹技术检测海马神经元中TrkB和p-TrkB蛋白的表达情况，Quantityone软件对TrkB及p-TrkB的灰度值进行分析，p-TrkB与TrkB的比值表示BDNF-TrkB通路的激活状态。方差分析进行统计学分析，检验水准a=0.05，数据使用SPSS19.0统计软件包进行分析，p≤0.05为有统计学意义。癫痫模型的制备方法是：细胞培养至第7d时，用“无镁”细胞外液处理3h，建立大鼠海马神经元癫痫模型。转染miR-1

7、32组的处理方法是：培养至第7d时加入miR-132慢病毒稀释液，24h后换成完全培养液继续培养24小时。加入BDNF组的处理方法是：于提取蛋白前10min在培养液中加入BDNF。结果：1、膜片钳技术检测海马神经元痫样放电：与正常组相比，体外培养7d后的癫痫模型组大鼠海马神经元自发性放电频率明显增加（p=0.001）。I天津医科大学硕士学位论文2、荧光定量PCR法检测miR-132表达示：与正常组相比，癫痫组miR-132表达明显增加，差异有统计学意义（p＜0.001）。3、蛋白免疫印迹结果显示：⑴与癫痫组相比，正常组p-TrkB/TrkB值较高，差

8、异有统计学意义（p=0.008）；⑵与正常组和相比，正常+BDNF组p-TrkB/TrkB值升高，差异有统计