非小细胞肺癌中mir-486-5p对pim-1基因表达调控的作用研究

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2、已经发表或撰写的研究成果，指导教师对此进行了审定。本论文由本人独立撰写，文责自负。研究生签名：降毒11中新擗芍对．Ⅻ}拳年≥其礴日目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯l英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4研究论文非小细胞肺癌中miR-486．5p对Pim．1基因表达调控的作用研究前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7翮吾⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯

3、21附图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯24附表⋯⋯⋯⋯⋯⋯·⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯··34讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯40结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯43参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯45综述microRNA与肿瘤⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯49致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯68个人简历⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯69中文摘要非小细胞肺癌中miR-486．5p对Pim．1基因

4、表达调控的作用研究摘要目的：MicroRNA(miRNA)是一类．22nt的非编码RNA，主要通过严格或不严格碱基配对机制结合到所调控靶基因mRNA的3'lYrR(3’untranslationalregion)区，从而干扰mRNA稳定性以及蛋白的转录过程，发挥其对基因表达的负调控作用。我们前期研究发现miR-486．5p是人非小细胞肺癌(Non—Small—CellLungCancer，NSCLC)中最显著低表达的miRNA之一，其在痰液和外周血中表达的变化对于NSCLC早期诊断具有重要临床价值。此外，我们研究发现miR-486—5p在肺癌中的作用为抑癌基

5、因，它的低表达促进肺癌的形成及进展过程，但是目前其作用机制尚不完全明了。本研究拟在前期研究基础上，进一步探讨miR-486．5p作用的靶基因，为揭示其在NSCLC中的作用机制奠定基础。方弦：首先利用生物软件对miR-486．5p作用的靶基因进行预测，之后通过构建含有Pim-1mRNA3’-UTR区的报告基因载体，利用双荧光素酶报告基因方法检测miR-486—5p对Pim．1的调控作用。在此基础上，在筛选获得的稳定表达miR-486—5p的细胞株中，利用WestemBlot和Real-timePCR方法检测细胞中Pim-1的表达情况。进一步在24对人NSCLC

6、肿瘤组织及配对的正常肺组织中检测miR-486．5p和Pim-1的表达情况。通过上述实验，观察miR-486．5p对Pim-1表达的调控作用。结果：1生物软件预测Pim一1可能为mi_R-486．5p作用的靶基因我们利用miRNA靶基因预测软件miRecords及miRsearch对mi_R-486．5p所作用的靶基因进行了分析。预测结果表明，在所有32853个预测基因中，Pim．1位列第24位。反过来，对可能结合于Pim-1mRNA3’-UTR区的miRNAs进行预测，表明miR-486．5p位于前10位。综合结果提示Pim．1可能是miR-486—5p调

7、控的靶基因之一。2构建Pim．1．3’一UTR报告基因载体中文接要根据上述预测结果，将包含主要预测位点在内的1200-bpPim—l一3'-UTR区域，通过PCR扩增构建Pim-1．3'-UTR报告基因载体(pGL3一Pim-1)。根据酶切结果筛选出阳性克隆，进一步提取阳性克隆的质粒进行测序，结果证实序列与GenBank(NM002648．3)提供的碱基序列完全一致，pGL3．Pim-1报告基因载体构建正确。3双荧光素酶报告基因检测miR-486—5p对Pirn一1的调控作用与对照组相比，实验组细胞中Pim一1．3’．UTR荧光素酶活性降低了大约70％，结果

8、表明miR-486．5p可以直接结合于Pim-1mR