pim-1在人非小细胞肺癌中的表达及其作用的实验研究

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1、河北医科大学硕士学位论文Pim--1在人非小细胞肺癌中的表达及其作用的实验研究姓名：田馨申请学位级别：硕士专业：病理学与病理生理学指导教师：邢凌霄；张祥宏201203中文摘要Pim．1在人非小细胞肺癌中的表达及其作用的实验研究摘要目的：Pim．1基因定位于人类6号染色体短臂21区(6p21)，其编码蛋白属于丝／苏氨酸激酶家族，它与川甜激酶一起被认为是调节细胞生存以及代谢的两大重要的激酶成员。Pim一1作为一种癌基因，可单独或协同其他癌基因(c．myc，N—myc等)诱导细胞恶性转化；引起基因的不稳定性；以及促进细胞增殖、抑制凋亡等，从而参与肿瘤的发生及进展过程。Pim一1是许多细胞因子

2、信号通路下游重要的效应器之一，其表达可被多种细胞因子、丝裂原以及激素所诱导。目前有关癌基因Pim．1的研究主要见于血液系统恶性肿瘤，并且其特异抑制剂的抗肿瘤作用已到达临床前期阶段。而在实体瘤的相关研究主要见于前列腺癌。目前有关Pim．1在非小细胞肺癌(NSCLC)中的研究少见报道。鉴于此，本文对其在非小细胞肺癌中的表达及其生物学功能进行了较为系统的实验研究。方法：，1Pim．1在人NSCLC中的表达情况利用WesternBlot方法，检测27例非小细胞肺癌及其匹配的正常肺组织以及NSCLC细胞株(H460，A549，H1299，H157，SK及H358)中Pim．1蛋白的表达；同时采用

3、Real-timePCR方法检测上述其中24例标本中Pim．1mRNA的表达；采用免疫组织化学染色明确Pim．1蛋白在NSCLC组织中表达的定位。2Pim．1在NSCLC中的生物学功能研究利用特异性Pim．1siRNA转染A549和H1299细胞，从细胞增殖(MTT及平板克隆形成)、细胞周期分布(FCM)及细胞迁移能力(划线实验及Transwell实验)方面，观察Pim．1在非小细胞肺癌中的作用。在体外实验的基础上，进一步通过制备裸鼠肿瘤模型，给予Pim．1shRNA质粒或对照质粒瘤内注射，观察敲低Pim．1基因后对肿瘤增殖的影响。3不同肿瘤微环境下Pim．1的表达情况分别给予A549

4、和H1299细胞EGF、CoCl2及抗肿瘤药物(Docetaxel、Cisplatin)后，观察Pim．1蛋白表达的变化(WesternBlot)以及对细胞增中文摘要殖的影响(MTT)。结果：1Pim．1在人原发非小细胞肺癌中的表达情况Westernbolt检测结果表明，在27例NSCLC病例中，24例肿瘤组织Pim一1蛋白的表达明显高于其匹配的正常肺组织。Real-timePCR检测结果表明，37．5％(9／24)病例中Pim．1mRNA在肿瘤组织中的表达显著高于其匹配的正常肺组织。进一步分析发现，Pim．1mRNA平均表达量在肿瘤组织与正常肺组织中的差异无显著性(p>O．05)。免

5、疫组织化学染色结果表明，Pim．1蛋白的阳性表达可见于肿瘤细胞胞核和／或胞浆中。此外，在6个NSCLC细胞株中检测了Pim．1蛋白的表达情况，除外H460为阴性表达外，其他细胞(A549、H1299、H157、SK-MES．1及H358)中均可检测到Pim．1蛋白的表达。2Pim．1在非小细胞肺癌中的生物学功能研究2．1利用siRNA干扰技术，体外观察Pim一1在非小细胞肺癌中的作用为进一步探讨Pim．1在肺癌中的生物学效应，我们采用siRNA干扰技术，将Pim．1siRNA转染A549和三T1299细胞，从细胞增殖、细胞周期分布以及迁移方面观察Pim．1在NSCLC中的作用。2．1．

6、1siRNA干扰效率的检测：于转染后48小时收集细胞检测Pim．1siRNA的干扰效率。Real-timePCR结果显示，与NegativeControlsiRNA(NCsiRNA)对照组相比，Pim一1mRNA的表达在A549细胞和H1299细胞Pim．1siRNA转染组细胞中分别降低了80％和86％。Westernblot检测结果同样表明，Pim'1蛋白的表达在Pim．1siRNA转染组明显低于对照组细胞。上述结果表明所用Pim．1siRNA序列可以有效干扰Pim一1的表达。2．1．2Pim．1siRNA转染对细胞增殖的影响：MTT检测结果表明，给予Pim．1siRNA转染后72h

7、和96h，A549细胞及H1299细胞的增殖活性明显低于对照组(p<0．05)。此外，在A549细胞中采用克隆形成实验观察了Pim．1siRNA转染对细胞增殖的影响。结果表明，Pim．1siRNA转染组A549细胞克隆形成数目较对照组明显减少。综上结果提示，Pim．1siRNA转染可抑制A549和H1299细胞的增殖能力。2．1．3Pim．1siRNA转染对细胞周期分布的影响：中文摘要FCM检测结果表明，与对照组相比，转染后48hPim—lsi