盾叶薯蓣三倍体细胞悬浮培养及植株再生

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1、CELLSUSPENSIONCULTURREANDPLANT鹧GENERATIONOFTRIPLOIDDIOSCOREAz矾G邛ERENsls札A忒TLETtheGraduateSchoolofHenanNormalUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofScienceByLuyieSupervisor：ProfJ,iMingl'unMay2014摘要盾叶薯蓣(DioscoreazingiberensisC．H．Wright)为薯蓣科薯蓣属多年生缠绕草质藤本植物，别名黄姜，火头根。其根茎中富含的

2、薯蓣皂苷元是合成甾体类激素和避孕药的主要原料，因人工难以合成，被人们称为“药用黄金”。本研究室利用组织培养技术，诱导胚乳培养获得了盾叶薯蓣三倍体试管苗，在此基础上，本文研究了盾叶薯蓣三倍体细胞悬浮培养及其植株再生过程，以期建立细胞悬浮培养与高频率植株再生技术体系，为利用盾叶薯蓣细胞大规模培养生产薯蓣皂苷元奠定技术基础。本实验的结果如下：1．愈伤组织的诱导与继代。三倍体盾叶薯蓣茎段愈伤组织诱导的适宜培养基是MS+2，4-D1．5mg·L1+6-BA1．0mg·L1，其诱导率达80．56％。经3～5代后，根据其颜色特征和质地，可分为I、II、III、IV四种类型。2．三倍体细胞悬浮培养体系的建立

3、及其生理生化特性的研究。选择颜色质地较好的I型愈伤组织建立细胞悬浮培养体系，细胞生长曲线呈“S”型，分为延迟期(0~3d)，对数期(3～12d)，静止期(12—15d)。细胞活力，可溶性蛋白质含量，均呈现先升高后降低的趋势，并且均在第6天达到最大值；细胞培养液的pH值先下降后趋于平缓，维持在4．8～7．0之间；培养液的电导率在12天时降至最低点，进入静期后，培养液的相对电导率开始回升，后渐趋于平缓；培养初期，培养基中磷酸盐、硝酸盐、铵盐浓度分别为118．75mg·L-1、2．44x103mg·L1、3．71x102mg·L～，培养结束时，培养液中分别有9．26％、20．47％、6．13％的磷

4、酸盐、硝酸盐、铵盐剩余；延迟期，细胞培养物中皂菅元合成速度较慢，3天后皂苷元迅速合成，9天时皂苷元含量达到最大，为O．58％，之后皂苷元含量下降，进入静止期后，皂苷元含量维持在0．41％左右。3．三倍体细胞悬浮培养体系的优化。盾叶薯蓣三倍体细胞悬浮培养保持良好的生长状态和皂苷元合成能力的适宜条件是：以3／4MS+NAA1．0mg·L-1+6-BA0．2mg·L1为培养基，4．5g-L’1(DW)的接种量，12天的继代周期，30g．L。1蔗糖作为碳源，pH值调至6．0左右。此外，研究了酵母、cu+诱导子及前提物质乙酸钠对细胞悬浮培养体系的影响。当酵母诱导子浓度为2．5％(v／v)时，细胞干重及

5、皂苷元含量最高，分别为18．77g·L-1和0．81％；当乙酸钠浓度为0．5mg·L以时，细胞的干重和皂苷元含量最大，分别为15．00g·L．1和0．79％。相对于对照，添加不同浓度的Cu2+对盾叶薯蓣三倍体细胞的生长及皂苷元没有促进作用。4．三倍体悬浮培养细胞的植株再生。适宜的分化培养基为MS+6-BA2．0mg·L-1+NAA0．4mg·L．1，培养180天可获得再生苗。将2~3grll的带芽茎段接种到生根培养基中，30天待根数增多且粗壮后进行驯化移栽，移栽茁成活率达8004。关键词：盾叶薯蓣，三倍体，愈伤组织，细胞悬浮培养，植株再生IIABSTRACTDioscomaz自唱西删缸C．H

6、．Wright．known懿yellowginger,rotorroot．Itsrootsrichinthediosgenin(commonlyknown勰saponin)arethemainrawmaterialsofsyntheticsteroidhormoneandsteroidpin,andbeacauseofitdifficulttosynthetesize，called”medicinalgold”bypeople．Itswildrc$ourcesa∞largelyplantedinHubei，Shanxi，Henanandother北画埘1s．Butduetoexcessive

7、excavation，thewildresourcesbecameextinct．Asthedevelopmentofsteroidhormonedrugsandtheexpansionofapplicationscope，thedemandofdiosgeninisina呛asingatarateof10％，thewild溺0I：lrc懿ofD．zingiberensiswillbecomeincreasi