铜绿假单胞菌群中的若干稀有耐药基因筛选及功能研究

《铜绿假单胞菌群中的若干稀有耐药基因筛选及功能研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、万方数据论文题目：铜绿假单胞菌群中的若干稀有耐药基因筛及功能研究答辩委员会主席：芒态答辩委员会成员：韭面羞金胜威万方数据温州医科大学硕士学位论文目录论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯4缩略词表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯8前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯9材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯26分析与讨论⋯⋯⋯⋯⋯

2、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯39参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯42附录⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯43。致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯“·47综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯48综述参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯59万方数据温州医科大学硕士学位论文铜绿假单胞菌群中的若干稀有耐药基因筛选及功能研究中文摘要目的：本文以高通量测序以及基因组信息分析手段，研究不同年份临床分离的211株铜绿假单胞菌(PA)携带的氨基糖苷类、13一内酰胺类耐药基因，并通过

3、克隆表达以及药敏实验验证其功能，阐明了铜绿假单胞菌耐药性形成的分予机制。另外，通过与数据库耐药性基因相关同源序列比较分析，发现本文若干耐药性基因两侧可能存在可移动DNA元件，并通过PCR产物测序验证可移动DNA元件的存在，通过对耐药基因相关可移动DXA元件的结构分析，为进一‘步研究病原菌耐药性基因的水平转移导致耐药性播散提供实验依据。方法：1、实验菌株：本文以温州医科大学附属第一医院临床201卜2013年分离得到的21l株PA菌株为研究对象，提取其混合基因组并进行solexa测序。2、耐药性基因参考序列的收集：收集GenBank、耐药基因数据库耐药性相关基因

4、序列，整理并去冗余，最后得到具有己知功能的151条氨基糖苷类耐药基因序列和81条B一内酰胺类耐药基因序列。3、混合基因组测序耐药性基因的筛选：通过一些生物信息工具(Blast、Perl、Clustalw、SamtoolS、GATK、Bwa、SOAPdenovo、MEGA)以上述两类耐药性基因为参考序列进行PA混合基因组测序读长mapping，分析这些耐药基因在PA中的分布情况以及丰度差异。根据mapping结果选出一些覆盖度高于0．9，丰度相对低的基因，且鲜有报道的基因作为靶基因进行研究。4、靶基因的克隆和功能测定：设计靶基因引物，以单个菌基因组DNA为模板

5、进行PCR扩增，筛选靶基因阳性PA菌株。对PCR扩增产物进行TA克隆并转化到大肠杆菌JM]09，提取重组质粒并通过双酶切，最后将靶基因连接入表达载体，再转化到工程菌大肠杆菌BL2]，在Amp板上筛选出阳性克隆，通过菌落PCR鉴定阳性克隆菌株。然后通过药敏实验来测定这些阳性克隆株对22种药物的MIC值，通过与阴性对照菌的MIC值比较来判断其耐药功能。5、耐药基因相关可移动DNA元件分析：首先用SOAPdenove软件对PA混合基因组短reads进行拼接，获得一些ContJgs和scaffolds，对序列进行注释并定位靶基万方数据温州医科大学硕士学位论文因所在的

6、序列片段，分析靶基因两侧序列中可能存在的可移动DNA元件结构，或以靶基因所在序列片段为咨询序列，搜索核酸序列数据库，提取数据库相似序列及其两侧序列，分析靶基因两侧可能存在的可移动DNA元件；根据分析结果，设计靶基因相关的可移动DNA元件序列片段的引物，通过PCR产物测序，验证靶基因相关可移动DNA元件在铜绿假单胞菌中的存在。结果：1．铜绿假单胞菌混合基因组高通量测序结果产生的短序列reads总数有70，239，195条，reads的长度均为lOOnt。将readsmapping到151条氨基糖苷类耐药基因序列和81条B一内酰胺类耐药基因序列上，最后发现有25

7、个氨基糖苷类耐药基因型和3个f3一内酰胺类耐药基因存在于铜绿假单胞菌中。其中氨基糖苷类耐药基因丰度最高的基因型为aph留’／)一历，丰度有1636．218X，覆盖度0．9988；丰度最低的基因型是aadAl2，丰度有2．2X，覆盖度80．1％。B一内酰胺类耐药基因丰度最高的基因型为bYa6ES,丰度有198．75X，覆盖度1；丰度最低的基因型是6儿7础丰度有4．24X，覆盖度0．9605。2．从211株铜绿假单胞菌中，PCR筛选出四株菌。TLl256、TLl257携带aph留’夕吖y基因型，而两菌株TLl280、TLl299含有blaGES基因型。3．PCR

8、产物测序结果分析，TLl256与TLl257中的ap