绿僵菌组成型启动子pmagpd和特异启动子pmagas1的结构与功能研究

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1、重庆大学硕士学位论文绿僵菌组成型启动子Pmagpd和特异启动子PMagas1的结构与功能研究姓名：焦润申请学位级别：硕士专业：生物学指导教师：曹月青20120604重庆大学硕士学位论文中文摘要摘要绿僵菌作为一类重要的生物防治真菌，可寄生多种昆虫，在生产中已得到了广泛应用。据不完全统计，全世界约有两百多种昆虫能被这种真菌感染致死。其具有触杀性，无污染，防止再猖獗等优点，但同其他生物农药一样，绿僵菌也同时存在杀虫效果慢、易受环境影响和效果不稳定等缺点，因而一定程度上限制了其大规模应用。因此，采用基因工程

2、手段对菌株进行改造，提高毒力、杀虫速度以及抗逆能力成为真菌杀虫剂研究的重要课题。目前，许多与毒力、抗逆相关的基因被逐步克隆，包括参与体表附着阶段的基因、参与表皮壁水解酶的基因、参与体壁穿透阶段的基因以及参与体内定植阶段的基因等。这些都为昆虫病原真菌菌株的改良奠定了良好的基础。对微生物的分子遗传改造通常需要对目的基因进行稳定重复的表达。利用强启动子、某时期特异启动子或可诱导启动子表达内外源基因对于科学研究与实际应用都有重要的意义。因此，利用高活力的启动子加强对上述毒力及抗逆基因的表达，是构建高毒菌株的

3、有效策略。本研究以绿僵茵为实验材料，在已知序列的基础上克隆了启动子的不同5’缺失片段，与报告基因GUS或EGFP融合，通过检测转化菌株报告基因转录或表达分析组成型启动子PMagpd和附着胞时期特异启动子PMagasl的结构和功能。主要研究结果如下：1．PMagpd的结构与功能研究1．1PMagpd生物信息学分析结果我们根据绿僵菌基因组序列设计引物，克隆Magpd上游约1700bp的序列，命名为PMagpd。与其他物种的gpd启动子进行序列比对，发现PMagpd启动子序列内不包含一些常见的顺式作用元件

4、TATA—box和CAAT-box。与PgdpA的比对结果显示，PMagpd内包含一些gpd启动子共有的顺势作用元件gpd—box，pgk—box，qa—box，qut—box和ct．rich区域，以及一些可能参与反式作用因子结合的正向、反向重复序列。1．2转化子验证结果根据PMagpd功能元件的位置，克隆不同长度(1691bp，1463bp，946bp，684bp，405bpl的PMagpd的5’缺失片段，与GUS基因片段融合插入pK2载体，用农杆菌介导转化绿僵菌。对初筛转化子进行PCR和sout

5、hernblot验证，PCR验证结果显示转化子为阳性转化子，杂交结果显示，转化子中PMagpd的拷贝数为1到3个不等。重庆大学硕士学位论文中文摘要1．3PMagpd缺失突变分析通过GUS酶活分析，结果显示，与包含gpd—box的1691bp启动子区相比，不包含gpd．box的1463bp的启动子活性无显著差异，推测gpd—box对于PMagpd为非必需元件；960bp和684bp的启动子活性分别下降了34％和39％，说明．1463bp-960bp和-960bp~一684bp区域内存在重要的启动子元件

6、。将PMagpd与PgpdA比较，活性为PgpdA的1．3倍。RT-qPCR检测GUS转录水平，结果显示启动子活性检测结果与GUS酶活性分析结果一致。2．PMagasl的结构与功能研究2．1PMagasl生物信息学分析结果分析绿僵茵Magasl基因组序列，设计引物，克隆Magasl上游调控区约1228bp的序列，命名为PMagasl。对该调控序列进行生物信息学分析，发现在PMagasl中含有基本启动子元件CAAT-box，GC．box和TATA．box和真菌启动子通用元件ct．box以及一些可能与反

7、式作用因子结合相关的正、反向重复序列。2．2转化子验证结果以EGFP为报告基因，采用5’缺失方法构建了不同长度(1228bp，897bp，611bp，377bp)启动子的表达载体。通过PCR和Southernblot验证转化子，拷贝数为1到3个不等。2．3PMagasl的时期特异性研究对含1228bp的全启动子的绿僵菌转化子各个时期进行EGFP荧光观察，发现只有在附着胞阶段才能检测到荧光信号；而在其他生长阶段都没有检测到信号，包括孢子、萌发，菌丝和转化子侵染的蝗虫期内的虫生体。说明该启动子仅在附着胞

8、时期具有活性。2．4PMagasl的缺失突变分析对各个缺失组的转化子的EGFP基因进行转录水平上的定量PCR分析，当缺失了．1228bp到．897bp区域的Del2组的活性没有明显的下降，而进一步缺失了一897bp到．611bp(Del3)的序列后，活性下降了接近70％，定点敲除掉．392bp到一328bp(LD)区域后，活性也下降82％，由此推断，这两个区域的完整性对于PMagasI活性的发挥是非常必要的。关键词：绿僵菌，三磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子，附着胞阶段特异