研究真核生物启动子结构与功能的方法.docx

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1、研究真核生物启动子结构与功能的方法研究启动子结构与功能的方法主要有缺失、点突变和足迹法。在分析得到了启动子的功能序列后，还要弄清与之结合的蛋白质及两者间的相互作用。在研究真核生物启动子的结构与功能时，常采用下列方法。（1）卵细胞系统（oocytesystem）该方法是将DNA直接注射人爪蟾卵细胞的细胞核，分析和观察RNA的转录情况。该方法的局限性在于试验条件受卵细胞内条件的限制。可以用来分析：DNA片段的特性，不能用于分析蛋白质因子与DNA间的结合。（2）转染系统（transfectionsystem）将外源DNA

2、导人转染的细胞并使之表达。表达可分为瞬时表达（transientexpression）和整合表达（integrantexpression）。由于转录是在细胞内完成的，可以看成是一种体内试验系统。但外源基因又不是细胞所固有的，和细胞固有基因的表达尚有差别。使用多种宿主细胞，可提高该系统的应用价值。（4）转基因系统（transgenicsystem）转基因系统将外源基因整合人动物的生殖细胞，使外源基因在部分或全部组织中表达。该系统和转染系统有一些相同的局限性，即外源基因常以多拷贝存在，整合的位置也和内源性基因不同。（4

3、）体外转录系统（invitro system）体外转录系统是一种经典的方法。它应用体外转录的方法，结合缺失突变和点突变，来筛选哪些序列是启动子的功能所必需的，哪些序列对启动子的功能有影响，以及哪些辅助因子对启动子或启动子中的某一片段有何种作用。启动子研究的第一步是确定启动子的位置及长度。主要方法是用缺失试验来确定启动子的上游边界，即当缺失影响转录始时，说明该处就是启动子的上游边界；用缺失试验结合重组试验来确定下游边界。确定了启动子的位置后，可采用点突变来研究每个碱基在启动子中所起的作用。研究蛋白质辅助因子与DNA（

4、启动子）的相互作用可采用DNase、足迹法、凝胶阻滞法和硫酸二甲酯方法等。