资源描述：
《拟南芥启动子功能研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、反向遗传学方法研究启动子关键序列摘要切除启动子的不同区段后通过报告基因的衣达强度來判断启动子的关键序列1.引言1.1拟南芥作为高等植物研究的模式植物的理由拟南芥命周期煎，仅冇一个月：这种杂草状的I•字花科植物，在所冇植物中基因组率先被完整破译.拟南芥只有五对染色体，基因组较小；基因操作方便。培养条件：气候室牛长,温度18-22°C,空气湿度70%-80%,光照强度300umol/sm2。MS培养基:Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳
2、定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例介适,能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。1.2报告基因（reportergene）报告基因是一种编码容易被检测的蛋白质或酶的基因，也就是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融介形成嵌介基因，或与其它日的基因相融合，在调控序列控制下进行农达，从而筛选得到转化体，并利用它的农达产物來研究目的基因的表达调控。报告基因一般具备以卜•特点：（1）报告基
3、因产物必须区别于转染前真核细胞内任何相似的产物；（2）受体细胞内其它的基因产物不会干扰报告基因产物的检测；（3）报告基因编码的产物的检测应该快速、简便、灵敏度高而且重现性好。选择何种报告基因系统是根据研究的目的、组织与细胞的类别、信号检测的时间性与空间性，以及首选的检测方法而定。报告基因gus基因存在于E.coli等一些细菌基因组内，编码B-葡萄糖苛酸酶。B-葡萄糖甘酸酶是一个水解酶，以B-葡萄糖井酸酯类物质为底物，其反应产物可用多种方法检测出来。由于绝大多数植物没有检测到術萄糖昔酸酶的背景活性，
4、因此这个基因被广泛应用于植物基因调控的研究中。下面是常用的GUS检测方法：（1）组织化学法检测以5-渙-4-氯-3」引味-[3-葡萄糖昔酸（X-Gluc）作为反应底物，将被检材料用含冇底物的缓冲液浸泡。若组织细胞发生了解gus基因的转化，并表达出Gus,在适宜的条件下，该猶就可将X-Gluc水解牛成蓝色产物。这是由其初始产物经氧化二聚作用于形成的靛蓝染料，它使具Gus活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，口在一定程度下根据染色深浅可反映thGus活性。因此利用该方法可观察到外源基因在
5、特定器官、组织，其至单个细胞内的衣达情况。最为常用。（2）荧光法（灵感度为分光光度检测法最高）以4-甲基伞形酮酰-P-D®萄糖醛酸昔为底物，GUS催化其水解为4-甲某伞形酮及B-D荷萄糖醛酸。4-甲基伞形酮分子屮的耗基解离后被365nm的光激发，产生455nm的荧光，可用荧光分光光度计定量。1.3盐芥液泡焦磷酸酶基因启动子（TsVPD科研工作屮发现，盐芥液泡焦磷酸酶基因启动子(TsVPl)在除了种子以外的所有组织小都有活性，它的活性在根和叶中能被盐诱导，尤其在根尖中。为了研究启动子的关键序列,构建
6、了盐芥液泡焦磷酸酶基因启动子(TsVPl)不同长度启动区控制的衙萄糖昔酸酶(GUS)载体pCAMBIA1391z(PTsVP::GUS),转染拟南芥,获得转基因拟南芥PT1,PA1和P7。发现PT1,PA1和P7具有不同的GUS活性及盐诱导活性。表明启动区长度对启动子功能有影响，由此推测启动子的关键序列及诱导特点。构建了盐芥液泡焦磷酸酶基因启动子(TsVPl)不同长度启动区控制的匍萄糖昔酸酶(GUS)载体pCAMBTA1391z(PTsVP::GUS),转染拟南芥,获得转基因拟南芥PT1,PT2和
7、P8PT9o1.实验材料2.1实验材料2.1.1材料拟南芥种子PT1、PT2、PT7、PT82.1.2试剂母液I(大量元素20X)为10ml,母液II(微量元索200X),III(铁盐200X),IV(有机成分200X),蔗糖，蒸锚水，NaOH溶液，HC1溶液，琼脂粉，NaCl,70%乙醇，10%次氯酸钠,0.1Ma2HP04,0.IMNaH2P04,10%0ml100mMK2Fe(CN)6,lOOmMK2Fe(CN)4,X-Gluc,DMF,90%丙酮。2.1.3器具pH计,玻璃棒,胶头滴管2
8、00ml量筒,10ml量筒,50讷量简,锥形瓶若干，培养皿,电子天平，髙压蒸汽灭菌锅，枪头，枪，记号笔，标签纸，密封条，离心管，冰箱，温箱,体视显微镜，照相机，烧杯。2.2实验方法2.2.1配制MS培养基MS培养基：Mumshige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐禽量高，其养分的数量和比例合适,能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。MS培养
