绵马素bb体外抗金黄色葡萄球菌活性及其作用机制研究

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1、万方数据UniversityCode：10225RegisterCode：S14685DissertationfortheDegreeofMasterInvestigationofantibacterialactivityandmechanismofaspidinBBagainstStaphylococcusaureusinvitroCandidate：Supervisor：AssociateSupervisor：AcademicDegreeAppliedfor：Speciality：Dateof0ralExamination：University：L1NaProf．FuYuji

2、eMasterPharmacognosyJune，2014NortheastForestry万方数据摘要

3、

4、IIIIIIIIIIIIIIIIIY2720857香鳞毛蕨属于鳞毛蕨属的一种，历来在民间用于治疗各种皮肤病，如痤疮，银屑病，皮疹和皮炎等。绵马素BB是从香鳞毛蕨中提取的典型的间苯三酚类衍生物，具有抗癌，抗蠕虫，抗病毒和抗菌等活性，但其抗菌机制至今尚未报道过。通过对绵马素BB体外抗菌活性进行初步筛选，发现其具有良好的抗金黄色葡萄球菌的活性，同时对正常细胞毒性较低，因而具有很好的开发前景。本文主要以绵马素BB为研究对象，研究其在体外对金黄色葡萄球菌的抗菌活性和其抗菌分子作用机制

5、。研究结果如下：1．绵马素BB对金黄色葡萄球菌具有良好的抗菌活性。采用肉汤稀释法及动态杀菌曲线考察绵马素BB对金黄色葡萄球菌(含标准株及临床株)的抗菌活性，结果表明，绵马素BB具有良好的抗金黄色葡萄球菌的活性，对一标准株和三株临床株的MIC值分别为15．63I．tg／mL，62．5I，tg／mL，31．2599／mL和31．251ag／mL；MBC值分别为31．25、125、62．5、62．5gg／mL。动态杀菌曲线的结果表明，绵马素BB能够在MBC的浓度下，4小时内将金黄色葡萄球菌完全杀灭，并且其抑菌及杀菌活性具有一定的浓度及时间依赖性。2．绵马素BB对非洲绿猴肾细胞(Vero

6、)无细胞毒性。采用MTT法评估绵马素BB的细胞毒性，作用72小时后，绵马素BB对tI@H绿猴肾细胞(Vero)的IC50值为48．14±1．52pM(22．11±0．70pg／mL)，表明，绵马素BB对正常细胞株的毒性较小，且当金黄色葡萄球菌死亡时，绵马素BB不会对正常细胞造成损伤。3．绵马素BB通过调节ROS依赖的关键酶的作用，使胞内ROS量升高，导致金黄色葡萄球菌的膜破裂，DNA和蛋白质降解，最终引起金黄色葡萄球菌死亡。(1)采用酶标仪检测调控ROS量的酶和非酶物质的变化及ROS量的变化。结果表明，绵马素BB能够显著增强NADPH氧化酶的活性，同时降低SOD(superoxi

7、dedismutase)的活性和GSH(glutathione)的量，从而导致ROS(reactiveoxygenspecies)的水平升高。同时抗氧化剂catalase的使用，可降低ROS的产生，进而提高金黄色葡萄球菌的生存率。这些结果表明ROS是绵马素BB发挥抗金黄色葡萄球菌作用的重要调控者。(2)绵马素BB能够使金黄色葡萄球菌细胞膜发生破裂。原子力显微镜在纳米级水平下检测了绵马素BB与金黄色葡萄球菌作用前后的形态学变化。随着绵马素BB浓度的增加，细菌的破坏程度加大，细胞膜出现不规则性，最后膜完整性丧失，导致胞质溢出，细菌尺寸变小，RMS粗糙度增加。同时，膜完整性测定、上清蛋

8、白质的释放及脂质过氧化测定表明绵马素BB对金黄色葡萄球菌膜的破坏程度呈时间及浓度依赖性上升。(3)绵马素BB能够使金黄色葡萄球菌中DNA发生裂解。琼脂糖凝胶电泳的结果表明，加入绵马素BB后的金黄色葡萄球菌的泳道内出现明显的DNA破碎。万方数据摘要(4)绵马素BB能够使金黄色葡萄球菌中蛋白质发生降解。SDS．PAGE的结果表明，绵马素BB可能是通过抑制金黄色葡萄球菌中的SarA(14．718kDa)，Fib(18．765kDa)，ferritin(19．589kDa)，ATP—dependentclpproteolyticsubunit(21．514kDa)，SOD(Mn／Fe)(

9、23．041kDa)，staph)rloxanthinbiosynthesisprotein(33．376kOa)，SeXpheromone(45．381kOa)，Iron—regulatedsurfacedeterminantproteinB(72．192kDa)andH(100．847kOa)蛋白而起作用的。综上所述，绵马素BB是通过激活NADPH氧化酶的活性同时抑制SOD的活性及GSH的含量来诱导ROS的产生，进而破坏细胞膜、DNA和蛋白质，最后导致细菌死亡。这些结果为绵马