槲皮苷对金黄色葡萄球菌sortase a的抑制作用及其机制研究

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1、本研究得到国家863项目（2011AA10A214）和国家自然科学基金（31272608）资助槲皮苷对金黄色葡萄球菌SortaseA的抑制作用及其机制研究InhibitoryeffectandmechanismofQuercitrinonStaphylococcusaureusSortaseA作者姓名：柳秉润专业名称：生物化学与分子生物学指导教师：王大成教授学位类别：理学硕士论文答辩日期：2015年6月5日授予学位日期：年月日中文摘要槲皮苷对金黄色葡萄球菌SortaseA的抑制作用及其机制研究金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus，简称金葡菌）是一种革兰氏

2、阳性机会致病菌，可引起多种致死性感染，例如心内膜炎、坏死性肺炎和败血症等，严重危害着人类的健康。耐抗生素菌株的出现，尤其是耐甲氧西林金葡菌（methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA）目前已经成为全球医院交叉感染的主要病原菌，而且发病率还在逐年递增。因此，当务之急是寻找新的抗菌靶点或抗菌策略，以解决日益严重的耐药性病原菌感染的问题。抗毒力策略目前被越来越多的学者所接受。在传统的抗菌策略中，抗生素往往意在通过各种手段抑制细菌的生长或杀死细菌，而抗毒力策略却不同，主要是通过抑制细菌内的毒力因子的活性或表达，从而削弱病原菌的致病性

3、。SortaseA（SrtA）是广泛存在于革兰氏阳性菌中的一种半胱氨酸转肽酶，负责将多种毒力因子表面蛋白锚定到细菌的细胞壁上。而细菌的表面蛋白正是负责病原菌的黏附、定殖、入侵和逃避机体固有免疫的关键毒力因子。因此，SrtA被视为是抗毒力策略的新靶点，对其抑制剂的筛选也成为研究热点。本实验采用荧光共振能量转移法来筛选SrtA抑制剂，并从发现的4种有显著抑制作用的中药单体化合物中选取效果最好的槲皮苷，进行动物实验研究和机制研究。本实验发现了槲皮苷还具有良好的抗金葡菌SrtA催化活性的作用。进一步通过蛋白结合实验评价了槲皮苷在菌体内对SrtA蛋白活性的影响；通过绘制生长曲线明确其

4、是否具有抑菌活性；通过动物实验对槲皮苷进入生物体内后能否有效地发挥作用进行了研究；最后通过分子模拟实验探讨了槲皮苷与SrtA蛋白的作用机制。结果表明，槲皮苷不会影响金葡菌的生长，但可以通过抑制金葡菌SrtA活性从而达到干预细菌黏附的作用。随着槲皮苷浓度的升高，其对金葡菌黏附能力的抑制效果也随之增加，两者之间呈剂量依赖关系。抑制金葡菌50%的黏附率时的槲皮苷浓度为32.18±5.36μg/ml，进一步验证了槲皮苷抑制金葡菌SrtA活性的作用。动物实验结果表明，槲皮苷对金葡菌引起的小鼠肾脓肿具有I一定的治疗保护作用。分子动力学模拟实验结果表明，槲皮苷与SrtA蛋白的活性结合位点

5、是Gly167和Val193。综上所述，槲皮苷可以作为一个以抗毒力策略治疗细菌感染的先导化合物，为进一步开展新型药物的设计和研发提供了重要的实验数据和理论依据。关键词：金黄色葡萄球菌；SortaseA；槲皮苷；黏附；肾脓肿IIAbstractInhibitoryeffectandmechanismofQuercitrinonStaphylococcusaureusSortaseAStaphylococcusaureus(S.aureus)，aGram-positiveopportunisticpathogenicbacteriawhichcancausemultiplein

6、fectiousdiseasesthatthreatenhumanhealthseriously,includingendocarditis,necrotizingpneumoniaandsepticemia.Duetotheabuseofantibiotics,theantibiotic-resistantstrainswereisolatedrapidly,especiallythemethicillin-resistantS.aureus(MRSA)whichisreportedonlytwoyearsaftermethicillinwasappliedforthet

7、reatmentofpenicillin-resistantbacteria.AndMRSAspreadthroughoutofworldjustin10years.ThereducedefficacyofvancomycinandlinezolidagainstMRSAmakesresearchintodevelopingnewtreatmentoptionsapriority.Therefore,theurgentaffairnowistosolvetheproblemofantibiotic-resistan