节旋藻形态建成相关蛋白（smr1）的分子特征及抗体制备

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1、浙江大学硕士学位论文节旋藻形态建成相关蛋白（SMR1）的分子特征及抗体制备姓名：陈晓燕申请学位级别：硕士专业：生物物理学指导教师：汪志平20060501摘要一、SMRl的分离与纯化通过对3株节旋藻原螺旋形藻丝、由螺旋形变直的藻丝，以及直线彤回变成螺旋形的藻丝所作的蛋白质SDS．PAGE分析表明，螺旋形与直线形藻丝间奄少存有5个差异蛋白，分别位于53．1、52．0、318、21．9和20．3kDa处。以钝项节旋藻Sp。S为材料，对其中差异较明显、位于21．9kDa处的蛋白(SMRI)进行分离与纯化，主要步骤、技术参数与结果如下

2、：(1)采用冻融法破芥节旋藻细胞，SMRl提取液的最佳pH为6．8；(2)硫酸铵分级沉降可有效去除杂蛋白，SMRl主要在硫酸铵饱和度为40～50％的级分中；(3)用Tris．HCI缓冲液溶解硫酸铵沉降级分并依次经SephacrylS-200凝胶过滤层析、Q—SepharoseI：F强阴离子交换层折后，剖得了I乜泳纯的SMR】，提取率约为柑提液总蛋白的0065％。二、SMRl的分子特征纯化后SMRI的双向电泳分析显示，其纯度大]：90％，等电点(pI)为498：刚一：色潜分析结果表明，SMRl的二级结构中。．螺旋、0，折叠和无

3、规卷曲的组成依次为3l％、12％和57％。同时，ESI。MS鉴定结果显示SMRl中有5条肽段、共53个氨蟮酸的序列与藻蓝蚩白连接多肽Cpcl的高度一致，且分布于CpcI笫30～10l位氮基酸残基IXJ；N．端测序结果显示SMRl的N．端序列与Cpc[的箱30～44位氮基酸序列完全一致；MAI，DI，TOFMS测得SMRl的精确分子量为l6712Da。由上述结果推测$MRl很可能是一种由CpcI基因表达并经修饰后形成、氩基酸序列与Cpcl中第30～I71位一致的同源蛋白。考虑到不同藻株问CpcI基因的差异，我们应用PCR等技术

4、从Sp．S中克隆出cpcH[D的操纵于并进行测序，进而根据sp．s中SMRl的核昔酸』F列推导得其氨基酸序列。生物信息学分析结果显示，根扼SMRl氨基酸序列预测出来的分子量、等电点、二级结构等珲论值与测得的实验值非常吻合，并可能由7个。一螺旋形成结构域，在节旋藻形态建成中行使其生物学功能。、SMRl的原核表达及抗体制各由于从节旋藻中提取并分离纯化SMRI的得率低，难以满足抗体制备等实际需要。夺研究应用转基因原核表达策略，通过对目的蛋白诱导温度与时间等表达条件优化，并应用镍亲和层析等分离搜术获得了足量、电泳纯的SMRj产物。其

5、中，所构建的表达顷粒中目的蛋白诱导表达的适宜温度为25～30℃、时问为6-12h。同时，进～步以原核表达所获得的SMRl为抗原，通过免疫黑眼纯种新西兰兔制备抗体。菇进行了4次免疫，每次免疫的蛋白量依次为】、0．5、O．5和O．5mg。晟后一次免疫结束两同后，颈动脉放血并收集血清。通过间接EI_，ISA捌Westernblot对所制抗体的特异性和效价等分析表明，效价高达1：51200，日．均能与原核表达的SMRl，以及节旋藻中的SMRl发生免疫反应。这说明所制备SMRl抗体的效价高、特异性好，从而为进一步利用免疫共沉淀、蛋白质

6、互作、蛋向质芯片等技术深入研究并揭示SMR1对节旋藻形态建成的生物功能与调控婀络等奠定基础。关键词：饨顶早旋藻；形态建成：蛋白质：分离纯化；分子特征；原核表达抗体IIAbstractLTilepurificationofSMRlTheproteinsSDS—PAGEanalysesofthewild-typedrthrospiraplatensisstrainsSp—S，Sp—BandSp-Twithregularhelicalmorphology，andtheircorrespondinglinearvarietiesan

7、dtherevertantvarietieswereperformedTheresultsindicatedthattherewere5significantlydifferentbandsinCOlrlmOllbetweenthehelicalandlinearfilaments、whichwerelocatedat531，520，3I．8，21．9and20．3kDa，respectively．Fm-thermore，usingthefollowprocessandconditions，themostsignifican

8、tbandat21．9kDawaspurlfledfromSp—S．Firstly,thesolubleproteinextraclswasextractedwithTris，hrCl(pl‘I68)，Secondly，inordertoremovepartofotherproleinse