小白菊内酯通过pgam5诱导结肠癌细胞坏死机制研究

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1、南方医科大学2011级硕士学位论文小白菊内酯通过PGAM5诱导结肠癌细胞坏死机制研究ParthenolideInducedthenecrosisofColonCancerCellsthroughPGAM5课题来源：广东省科技计划(20118031700001)学位申请人导师姓名专业名称培养类型培养层次培养单位杨雨彭康教授孙学刚教授中药学学术型硕士研究生中医药学院2014年5月23日广州硕士学位论文小白菊内酯通过PGAM5诱导结肠癌细胞坏死机制研究硕士研究生：杨雨指导教师：彭康教授孙学刚教授摘要IIIIIIIIIIIUllIIIIIIlY2617841背景与目的结直肠癌(

2、colorectalcancer,CRC)是常见高发于结直肠部位的消化道恶性肿瘤，作为世界四大癌症之一，每年全球发病人数超过100万。结直肠癌早期以手术治疗为首选，但早期症状不突出，待患者确诊时已属中晚期。因此，化疗和药物治疗为结肠癌患者延长生命、提高生活质量发挥着重要作用。然而，现有抗肿瘤化学治疗药物均有不同程度的毒副作用。在发挥治疗作用的同时，又侵害正常组织。并随着患者对现有化疗药产生耐药后，疗效显著下降。所以，对新型、低毒、高效、价廉的药物的研发是十分必要的。目前癌症常用药物，尽管有不同的靶位性和作用机制，但经临床反复用药，肿瘤细胞普遍出现耐药性。在现今结肠癌患病

3、率逐年增高的情形下，研究一种能够抵抗耐药性并诱导结肠癌死亡的药物，阐释其作用机制具有重要的科学价值和临床意义。菊蒿作为一种传统的中草药，具有镇痛、抗菌及抗肿瘤作用，可治疗发热、偏头痛及关节痛。菊蒿含有多种药理活性成分，其中小白菊内酯(Parthenolide，PTL)是从菊科植物菊蒿中提取的一种倍半萜内酯化合物，近年来研究表明，小白菊内酯不但具有抗炎抗免疫的药理作用，还有较强的抗肿瘤活性，并可以增强肿瘤细胞对其他多种抗肿瘤药物的敏感性。小白菊内酯能够抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的作用，如乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等恶性肿瘤。同时小白菊内酯亦可以诱导结肠癌细胞发生坏死

4、，但小白菊内酯对正常小肠上皮中文摘要细胞的作用及其诱导结肠癌细胞坏死机制尚不明确。鉴于此，本课题对小白菊内酯诱导结直肠癌细胞坏死及其调控机制进行研究。PGAM5(Phosphoglyceratemutasefamilymember5)磷酸甘油酸变位酶5，PGAM5的激活可以导致成串排列的线粒体发生线性断裂，这一现象在细胞坏死发生的早期起到了非常重要的作用。PGAM5异常激活亦可以诱导ROS和TNF-a的产生，促使癌细胞坏死的形。而氧化酶NOXl是产生活性氧ROS的关键酶，NOXl感受胞外信息刺激时能够迅速催化生成高浓度ROS，高浓度ROS会诱导细胞发生炎症，甚至是坏死。

5、PGAM5与NOXl蛋白与癌症细胞的坏死密切关联，但两者在促进结肠癌坏死机制中是否有存在相互作用，目前研究尚无报道。故本研究对小白菊内酯临床治疗结肠癌提供实验依据的同时，迸一步阐释了PGAM5和NOXI蛋白在结肠癌坏死中所起的作用。方法1．小白菊内酯对结肠癌细胞和正常小肠上皮细胞活力的影响选用SW480、DLDl、HCTl16三种结肠癌细胞和IEC．6正常小肠上皮细胞，37。C5％C02培养。收集对数期细胞，调整细胞密度约10000／孑L(96孔板)。待细胞贴壁后，分别加入浓度梯度的PTL(511mol／L、101．tmol／L、20“mol／L、401．Lmol／L，

6、后表示为5肛M、10rlM、20}lM、409M)，每孔100}_tl。每个浓度设4个复孔，同时设立空白对照组，给药后分别培养6h、12h、24h、48h后，每孔中加入5mg／mLMTT209L，继续培养4h。弃旧液，每孔加入150pL二甲基亚砜，置摇床振荡10min，至紫色结晶完全溶解。酶联免疫检测仪OD=490nm处测量吸光值。细胞生存率=试验组吸光度值／对照组吸光度值。实验重复3次后，统计分析。2．Hoechst33342／PI染色观察小白菊内酯作用结肠癌细胞后细胞核形态学变化细胞培养铺板方法见方法1，待细胞贴壁后，分别加入浓度梯度的PTL(10I．tM、201x

7、M、401xM)，每孔100l止。每个浓度设4个复孔，同时设立空白II硕士学位论文对照组，给药后分别培养6h、12h、24h后。用PBS将20mg／mLHoechst33342储存液制备成5．1099／mL工作液。贴壁细胞弃培养基，用PBS清洗1．2次。每孔加入359LHoechst33342工作液，置于37℃温育15．20min。弃Hoechst33342染液，PBS洗涤1．2次，加入50rtg／mL的PI工作液，用荧光显微镜拍照分析统计。实验重复三次。3．AnnexinV-FITC／PI双染流式细胞术检测细胞坏死率SW480、DLDl