生育三烯酚诱导结肠癌细胞死亡的死亡方式及机制研究

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1、分类号：R114密级：学位类别：科学学位团专业学位口◇学校代码；10062学号：2010602147学科门类：医学又坪暑科^号硕士学位论文MASTER’SDISSERTATIoN论文题目：生育三烯酚诱导结肠癌细胞死亡的死亡方式及机制研究TITLEMannerandmechanismofdeathtocotrienolinducedoncoloncancercells一级学科：公共卫生与预防医学二级学科：卫生毒理学论文作者：马跃指导教师：王风山研究员导师组成员：张静姝副研究员天津医科大学研究生院二

2、。一三年五月学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：!遨日期：M并‘月刁日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫

3、描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。保密口，在——年解密后适用本授权书。本论文属于不保密团。(请在相对应的方框内打“√”)学位论文作者签名：导师签名：山I】1年6月^目知t许‘月苫日天津医科大学硕士学位论文中文摘要目的本研究旨在通过体外培养人结肠癌SW620细胞、HCT-8细胞，利用分子生物学实验技术，通过多个角度证实生育三烯酚诱导结肠癌细胞死亡的死亡方式为paraptosis样死亡，并以paraptosis样死亡方式为中心，探讨生育三烯

4、酚诱导结肠癌细胞发生的机制。方法1．生育三烯酚诱导人结肠癌细胞死亡的方式研究体外培养人结肠癌细胞，加入不同剂量的6一生育三烯酚(1、2．5、5、10、15、20、25、30和401xmol／L)和乙醇(溶剂对照)作用24h后，以MTT实验观察6一生育三烯酚对SW620细胞存活率的影响；按照5、10、15、20“mol／L6一生育三烯酚作用于细胞，以荧光染色(AO／EB染色，DAPI染色)观察细胞死亡情况。按照20pmol／L弃lJ量加入6一生育三烯酚，通过JJ口,Z,paraptosis抑制剂放

5、线菌酮观察其对生育三烯酚作用的影响情况，来正面证实生育三烯酚诱导人结肠癌细胞死亡的方式中存在paraptosis样死亡。以不同剂量的6．生育三烯酚作用于人结肠癌细胞SW620中，检测细胞中caspase一3的活性，并用抗癌阳性药物紫杉醇作为肿瘤细胞凋亡诱导剂作用于SW620细胞中，利用DNALadder方法检测细胞中DNA的降解情况，从而证实生育三烯酚诱导人结肠癌细胞死亡并非典型凋亡方式。利用免疫细胞化学检测细胞中细胞自噬标记蛋白LC3的表达情况来观察生育三烯酚诱导人结肠癌细胞产生的这种空泡化死

6、亡现象与细胞自噬的关系，从而排除细胞自噬的可能，从反面证实生育三烯酚诱导人结肠癌细胞死亡的方式为paraptosis样死亡。为了排除细胞系的特异性，本实验中增加了另一种人结肠癌细胞系，HCT-8细胞。将v一生育三烯酚作用于HCT-8细胞，观察细胞死亡情况，同时检测细胞中caspase-3的活性，作为细胞系平行实验。2．6．生育三烯酚诱导人结肠癌细胞SW620死亡的机制研究体外培养SW620细胞，加入的20LLmol／L6一生育三烯酚作用24h后，通过免疫细胞化学矛[1westembloting的

7、方法检测细胞内质网膜蛋白标志物钙连蛋白和内质网应激标记蛋白Bip的表达情况，检测6．生育三烯酚诱导人结肠癌细胞出现空泡化死亡的现象与内质网应激的关系；在SW620细胞中加入wnt通路抑$蛴JJFH535天津医科大学硕士学位论文抑制细胞中wnt通路的激活，观察细胞的形态学变化，并利用westernbloting方法检Nwnt通路关键因子B．catenin的表达量变化，检测6一生育三烯酚诱导人结肠癌细胞死亡与Wnt通路的关系。结果1．与乙醇对照组相比，6．生育三烯酚作用于结肠癌细胞SW62024h后

8、，各剂量组均可以使SW620细胞存活率降低(p<0．05)，且细胞存活率随着6．生育三烯酚剂量的增加呈现降低的趋势，IC50值为15．181xmol／L。丫一生育三烯酚作用于结肠癌细胞HCT-824h后，各剂量组均可以使HCT-8细胞存活率降低(p<0．05)，且细胞存活率随着Y．生育三烯酚剂量的增加呈现降低的趋势，ICs0值为32．69mol／L。2．生育三烯酚作用于结肠癌细胞Sw620和HCT-8后，细胞内均未见细胞核不规整，核染色体DNA浓缩、着边呈新月状，凋亡小体生成等典型凋亡现象，取而