玫氏新本尼登虫（neobenedenia melleni）组织蛋白酶l基因克隆、表达及上游调控序列研究

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1、中山大学博士学位论文玫氏新本尼登虫（Neobenedeniamelleni）组织蛋白酶L基因克隆、表达及上游调控序列研究姓名：饶颖竹申请学位级别：博士专业：水生生物学指导教师：杨廷宝20070604论文题目：玫氏新本尼登虫(Neobenedeniamelleni)组织蛋白酶L基因克隆、表达及上游调控序列研究专业：水生生物学博士生：饶颖竹导师：杨廷宝教授摘要组织蛋白酶(cathepsin)是一类主要存在于溶酶体中的蛋白水解酶。寄生虫组织蛋白酶的功能涉及到寄生虫的营养摄取、生长发育、组织分化、脱包囊，包囊形成、脱鞘出膜、宿主细胞组织入侵及免疫逃逸等过程。是抗寄生虫化学药物及疫苗设计

2、的重要靶分子。本研究采用RACE-PCR及反向PCR等技术方法，首次克隆了对多种海水养殖鱼类有严重危害的单殖吸虫一玫氏新本尼登虫组织蛋白酶L(cathepsinL)基因的全长cDNA、基因组编码序列及上游转录调控序列，并对其氨基酸序列、基因结构及转录因子结合位点进行了序列分析；应用RT-PCR方法对cathepsinL在玫氏新本尼登虫不同发育时期的mRNA表达进行了半定量分析；建立了cathepsinL的原核及真核表达系统，表达和纯化了重组cathepsinL蛋白，并以纯化的重组cathepsinL蛋白制备了高效特异性玫氏新本尼登虫eathepsinL的抗血清。对catheps

3、inLDNA序列的分析揭示了玫氏新本尼登虫cathepsinL的基因结构及其上游调控序列存在的多个潜在的转录因子结合位点。主要研究结果如下：1．玫氏新本尼登虫cathepsinLcDNA序列全长1070bp，其中5’端非翻译区长20bp，开放读码框长1008bp，3’端非翻译区长42bp。推导的cathepsinL前体含有335个氨基酸，其中包括17个氨基酸的信号肤、100个氨基酸的前体肤及218个氨基酸的成熟肽。具有保守的酶活性位点氨基酸残基(c芦、H159和N17-5)及位于前体肽中的ERF／WNINmotif。同源性分析显示，玫氏新本尼登虫的cathepsinL与其它物种

4、的cathepsinL具有一定的同源性。2．玫氏新本尼登虫cathepsinL基因组编码序列长2221bp，由四个外显子及三个内含子组成，外显子的大小依次分别为427bp、226bp、161bp和236bp，内含子的大小依次分别为102bp、312bp和757bp。3．对玫氏新本尼登虫不同发育时期的cathepsinLmRNA的半定量RT-PCR检测结果显示，在刚排出虫卵及未出壳的钩毛蚴中没有检测到cathepsinLmRNA的表达，在自由游泳时期的钩毛蚴、童虫及成虫中均检测到其mRNA的表达，而在成虫期的表达量较高。结果提示cathcpsinL可能在玫氏新本尼登虫的发育过程中

5、发挥重要的作用。4．以成熟肽编码序列构建了原核表达载体pET-22b(+)／cathepsinL并在大肠杆菌中获得成功表达。重组蛋白以包涵体形式表达，经变性复性处理后，利用Ni2+金属螫合层析柱和SephadexG．25进行纯化和脱盐，获得的重组蛋白的纯度为96％，Westernblot结果证实，所获得的重组蛋白为带有6组氨酸标记的重组蛋白。以纯化的重组蛋白为抗原．免疫新西兰雄兔，ELISA、Westernblot结果显示，制备的玫氏新本尼登虫cathepsinL兔抗血清具有较高的效价和特异性。5．以编码preprocathepsinL的cDNA序列构建了C末端带有6组氨酸标记

6、的真核表达载体pcDNA3．O／cathepsinL，使用脂质体介导转染并在哺乳动物细胞293T中迸行了表达，利用抗6组氨酸抗体及制备的玫氏新本尼登虫cathepsinL兔抗血清进行间接免疫荧光检测。6．采用反向PCR技术克隆了玫氏新本尼登虫cathepsinL基因5’上游855bp韵序列，分析发现了多个潜在的转录因子结合位点如ocrl、Nrr2、GATA3、GATAl、GATA、GKLF、S√，I皿l、TCFll、Nkx2．5、Nkx3．1、Nkx3．2、S8、NFl及CCAATbox，但在克隆到的855bp上游序列中并不存在TATAbox。关键词：玫氏新本尼登虫，组织蛋白酶

7、L．cDNA克隆，重组表达，上游序列ⅡTITLE：cDNAcloning,characterization,5’upstreamsequenceanalysisandrecombinantexpressionofacathepsinL-likecysteinepmtcasefromNeobenedeniamelleni(Monogenca：Capsalidae)Specialty：HydrobiologyName：RaoYingzhuSupervisor：Prof．YangTingbaoAB