梅氏新贝尼登虫Mucin基因异构体的鉴定【开题报告】

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1、毕业论文开题报告生物技术梅氏新贝尼登虫Mucin基因异构体的鉴定一、选题的背景与意义梅氏新贝尼登虫(Neobenedeniamelleni)是世界上广泛分布的一类寄生虫，在许多种类的海水养殖鱼类体内均有发现，它们主要寄生在鱼类体表、鳃丝和鳍等部位，其分类位置为单殖目、分室科、新贝尼登虫属。寄生虫通过识别宿主体表分泌的黏液侵染宿主，以宿主体内血液或体表某些组织为食。受到感染的鱼体通过摩擦养殖网箱以制止皮肤搔痒，进而使自身皮肤大面积受伤糜烂，鳞片脱落，最终导致病鱼精神不定，拒食而亡(杨文川等,2001;Leong,etal,2002;黄艳平等,2003)。相关

2、文献报道称，梅氏新贝尼登虫病害经常在我国沿海地区爆发，给水产养殖业带来巨大损失，养殖鱼类感染此寄生虫的数目已占一半以上，在某些地区甚至已达100％(杨文川等,2004)。由此可见，对此类寄生虫的防治已迫在眉睫。目前针对梅氏新贝尼登虫的防治方法主要有 三：①淡水加 20 ×10-6氟本尼考等抗菌素浸洗 5～10min，绝大部分虫体变白脱落死亡，这也是本尼登虫病最安全、有效的防治方法，但缺点是操作繁琐、劳动强度较大； ②250×10-6福尔马林海水增氧浸洗 20min； ③用生石灰等泼洒或挂袋亦可防治。这些方法虽有一定疗效，但很难从根本上制止梅氏新贝尼登虫对鱼

3、类的侵害，尤其是难以杀死虫卵，使疾病屡治屡发。深入研究梅氏新贝尼登虫寄生过程的分子机制，开发针对关键蛋白的抗体药物成为控制此种疾病的关键。Mucin基因是生命体广泛表达的一类基因，其编码的黏蛋白是一类高度糖基化蛋白（HwardandCarolyn,2005），集中分布在呼吸道和消化道等组织的粘膜表面，行使润滑及保护的作用。蛋白骨架核心区域丝氨酸、苏氨酸残基上连接的大量寡糖链构成黏蛋白的基本结构，其中总分子量的一半以上由这些寡糖链占据。。科学家对梅氏新贝尼登虫和鱼类体表分泌的黏液成分进行分析，发现其中都含有Mucin基因家族编码的黏蛋白，EmmanuelRo

4、ger等研究证明它们在寄主的识别与入侵以及宿主的免疫反应中发挥着重要作用(EmmanuelandBenjamin,2008)。目前，国内对Mucin基因的研究才刚刚起步，国外对Mucin基因及其蛋白已经作了大量研究。初步对Mucin基因序列的分析与比对证明，这类基因是由可变数目的重复序列组成(VNTAvariablenumberoftandemrepeats，VNTRs)，因此具有多种异构体。其所编码的黏蛋白在核心蛋白部位具有相应的特异性连续重复模体(tandemrepeats，TRs)结构，它们也因此具有多态性（高峰等,2007）。推测这种多态性与寄主和

5、宿主进化过程中的双向选择具有密切关系（Georgios,etal,2001）。本课题对梅氏新贝尼登虫的RNA进行提取以获得其Mucin基因的异构体cDNA序列，通过分析与比对来鉴定此基因的分子特征，为进一步探究梅氏新贝尼登虫寄生过程中Mucin基因发挥的作用和寻找防治此种病原虫疾病的新方法提供理论依据。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题：研究的基本内容：本实验主要是从梅氏新贝尼登虫cDNA文库中获得Mucin基因异构体cDNA全长序列，并进行序列分析比对及糖基化分析，最后利用实时荧光定量PCR分析梅氏新贝尼登虫不同发育阶段Mucin基因的表达情况。拟解决

6、的问题：梅氏新贝尼登虫Mucin基因异构体分子特征鉴定。三、研究的方法与技术路线：（一）研究方法1.实验动物2007年8月采用咸淡水浸泡法，在浙江省宁波市象山黄避岙港湾水产养殖育苗中心养殖的大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)体表分离梅氏新贝尼登虫成虫，经系统寄生虫学的鉴定，暂养于海水中至肠道内含物排空后，用无菌双蒸水反复冲洗虫体后置于Eppendoff管中，-70°C冰箱保存备用。2.总RNA提取利用RNAiso试剂提取健康香鱼肝脏组织总RNA：(1)将100mg-70℃保存的样品在液氮中研磨成粉末，然后加入1mlRNAiso组织(以下为加入

7、1mlTrizol试剂标准)。(2)研磨后转入1.5mlEppendorf管中，剧烈振荡混匀，室温放置5min。4℃，12000rpm离心5min。(3)取上清，移至新的EP管中，加入1/5体积氯仿，用力振荡15s，充分混匀，室温放置2-3min。4℃，12000rpm离心10min。(4)底层为氯仿相，中层为蛋白相，上层是含RNA的无色水相。将上清转入一新的离心管(注意不要吸入蛋白层)，加入0.5ml氯仿于上清，振荡混匀，室温放置2-3min。4℃，12000rpm离心10min。(5)将上清转入一新的离心管，加入与上清等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置

8、10min。4℃12000rpm离心10min，去上清。(6)加入