梅氏新贝尼登虫发育过程中的HSP70表达分析【开题报告】

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1、毕业论文开题报告生物技术梅氏新贝尼登虫发育过程中的HSP70表达分析一、选题的背景与意义：梅氏新贝尼登虫(Neobenedeniamelleni，在日本，又名妃新贝尼登虫)是单殖目、分室科、新贝尼登虫属生物，世界上广为分布，在我国，广泛寄生于南方海水网箱养殖的名贵经济鱼类如大黄鱼、高体鰤、石斑鱼和鲷科鱼类的体表、眼眶或鼻腔等处。温度较高时，此寄生虫快速繁殖生长，易使上述感染对象患上夏秋季综合症，鱼类受感染的数量和程度都很大，受到感染的鱼极为难受，不停游动或擦网，寄生虫会破坏鱼类的表面粘液组织，诱发细菌和寄生纤毛虫感染，从而

2、导致体表导致渔区网箱养殖鱼类大批死亡。特别是近年来频繁出现在我国东南沿海一带的新贝尼登虫病，其带来的影响十分严重，不仅会危及到我国东南沿海水产养殖业的发展，同时，当地大量鱼类的受害会间接导致与之相关的生物圈发生巨大的变化，甚至有可能导致生态失衡。热休克蛋白(HeatShockProteins,HSPs)又称为应激蛋白，是在细菌到哺乳动物中广泛存在的一类热应激蛋白质。它是生物细胞在受热、生物应激、理化因素等应激原刺激后，发生热休克反应时所产生的一类在生物进化中最保守并由热休克基因所编码的伴随细胞蛋白。目前已发现在环境胁迫因子

3、(如高温、重金属和微生物感染等)的刺激下，其表达量显著增加。许多热休克蛋白具有分子伴侣的性质，因此HSP是一些在进化上非常保守的蛋白质家族。依蛋白质分子大小，可以将热休克蛋白分为五类，即HSP100，HSP90，HSP70，HSP60以及小分子热休克蛋白smHSP。HSP70蛋白质家族是其中功能上较广的一种，也是被研究的最为深入的一种HSP蛋白。它不仅能够在热胁迫下表达，而且几乎是所有活体细胞中的重要成分。HSP70家族作为分子伴侣在许多生物学过程中起到了重要作用。因此，研究HSP70家族及其系统的功能结构十分重要。由于H

4、SP在进化过程中的高度保守性，作为一种有效的分子标记，不少学者通过HSP序列分析研究分子流行病和系统进化之间的关系。本课题通过提取梅氏新贝尼登虫的RNA，使用PCR技术获取其HSP70序列，并分析其表达和功能表征，从而研究不同发育阶段梅氏新贝尼登虫的HSP70的表达，为进一步探究HSP70在动物体内的功能和防治此类病虫害的方法提供理论基础，同时构建出来的进化树可以用于比较分析不同物种的HSP70氨基酸序列特征，以期为这些鱼类的抗逆、应激效应的深入研究提供依据。二、本课题研究的内容与拟解决的主要问题：研究的内容：本课题主要研

5、究的是1)梅氏新贝尼登虫成虫、虫卵和钩毛蚴三个发育阶段样品的获得和保存；2)提取各个发育阶段梅氏新贝尼登虫的RNA；3)通过随机测序方法得到HSP70的基因序列；4)对获得的HSP70序列进行分析，而后进行进化树的构建、分析；5)采用荧光定量PCR，检测三个不同发育阶段的梅氏新贝尼登虫的HSP70的表达差异。拟解决的问题：1)获取不同发育阶段梅氏新贝尼登虫的RNA2)获得梅氏新贝尼登虫的HSP70的cDNA序列3)梅氏新贝尼登虫发育过程中的HSP70表达分析及进化树分析三、研究的方法与技术路线：研究方法：1)梅氏新贝尼登虫

6、样品的收集本次课题中的实验用虫采自宁波象山黄避岙三个发育阶段的虫体：①成虫：采集感染梅氏新贝尼登虫的大黄鱼病鱼暂养于120L水族箱，咸淡水浸泡病鱼后，用镊子小心取下体表成虫，暂养于过滤海水中至肠道内含物排空，过滤海水冲洗虫体粘液后置于Eppendoff管中，液氮速冻，-70°C冰箱保存备用。②虫卵：采集感染梅氏新贝尼登虫的大黄鱼病鱼暂养于120L水族箱，回流过滤器过夜抽滤，抽滤物经镜检观察分离出虫卵，过滤海水浸洗后置于Eppendoff管中，液氮速冻，-70°C冰箱保存备用。③钩毛蚴：将上述方法收集的虫卵放入盛有新鲜过滤海

7、水的培养皿中，置于25℃人工智能气候箱中培养，每天镜检观察虫卵发育情况并更换新鲜过滤海水，约4~6天钩毛蚴逸出后收集于Eppendoff管中，液氮速冻，-70°C冰箱保存备用。2）RNA抽提并纯化：从已采集的样本中提取各发育阶段的RNA利用RNAiso试剂提取上述样本中提取RNA：(1)将100mg-70℃保存的样品在液氮中研磨成粉末，然后加入1mlRNAiso组织(以下为加入1mlTrizol试剂标准)。(2)研磨后转入1.5mlEppendorf管中，剧烈振荡混匀，室温放置5min。4℃，12000rpm离心5min。

8、(3)取上清，移至新的EP管中，加入1/5体积氯仿，用力振荡15s，充分混匀，室温放置2-3min。4℃，12000rpm离心10min。(4)底层为氯仿相，中层为蛋白相，上层是含RNA的无色水相。将上清转入一新的离心管(注意不要吸入蛋白层)，加入0.5ml氯仿于上清，振荡混匀，室温放置2-3min。4