梅氏新贝尼登虫组织蛋白酶B克隆和序列分析【开题报告】

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1、毕业论文开题报告生物工程梅氏新贝尼登虫组织蛋白酶B克隆和序列分析一、选题的背景与意义梅氏新贝尼登虫(Neobenedeniamelleni)隶属单殖目、分室科、新贝尼登虫属,在世界范围内广泛分布,它主要寄生于重要海水养殖鱼类,如大黄鱼、鮸鱼、石斑鱼、真鲷、花鲈和牙鲆等鱼类体表、鳍和鳃丝等部位。虫体破坏宿主黏液组织,吸取宿主的血液或吞食体表组织,引起宿主皮肤搔痒而不停摩擦养殖网箱,进而导致皮肤溃疡糜烂和体表组织大面积创伤脱落,病鱼烦躁不安,食欲降低、厌食或拒食,容易因衰竭而死亡。近年来,由于养殖生态环

2、境变化及高密度养殖等原因,该病害在我国浙江、福建和广东沿海一带重要海水养殖地区频繁爆发,鱼群自然感染率平均为52.14%,最高感染率达100%,严重地影响我国沿海水产养殖业的发展。因此，梅氏新贝尼登虫病的预防和治疗具有重要意义。组织蛋白酶B具有广谱的蛋白水解活性，活性中心含有巯基，可以降解血红蛋白、血清蛋白、卵黄磷蛋白、层粘蛋白、纤维连接蛋白和Ⅳ型胶原等细胞外基质成分。血吸虫的肠道内存在组织蛋白酶B，可以为其提供营养。梅氏新贝尼登虫也应该有类似的特性。目前，利用植物基因工程技术已经克隆了水稻、小麦、

3、玉米等l5种不同来源的蛋白酶抑制剂cDNA，并通过基因枪或农杆菌介导等转化途径转人不同植物，其中大部分均获得了对昆虫具有明显抗性的转基因植株，解决了因大量使用化学药剂控制害虫而造成的环境污染问题。这梅氏新贝尼登虫病的预防有很好的指导和借鉴意义。本研究目的旨在为梅氏新贝尼登虫病的预防和治疗提供科学理论依据。二、研究的基本内容与拟解决的主要问题：研究的基本内容：本实验主要是提取梅氏新贝尼登虫总RNA，获得梅氏新贝尼登虫组织蛋白酶BcDNA序列，并进行序列分析及进化树构建。拟解决的问题：梅氏新贝尼登虫组织

4、蛋白酶B序列分析。三、研究的方法与技术路线：（一）研究方法1.实验动物2007年8月采用咸淡水浸泡法，在浙江省宁波市象山黄避岙港湾水产养殖育苗中心养殖的大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)体表分离梅氏新贝尼登虫成虫，经系统寄生虫学的鉴定，暂养于海水中至肠道内含物排空后，用无菌双蒸水反复冲洗虫体后置于Eppendoff管中，-70C冰箱保存备用。2.总RNA提取利用RNAiso试剂提取梅氏新贝尼登虫组织总RNA：(1)将100mg-70℃保存的样品在液氮中研磨成粉末，然后加入1mlRNA

5、iso组织(以下为加入1mlTrizol试剂标准)。(2)研磨后转入1.5mlEppendorf管中，剧烈振荡混匀，室温放置5min。4℃，12000rpm离心5min。(3)取上清，移至新的EP管中，加入1/5体积氯仿，用力振荡15s，充分混匀，室温放置2-3min。4℃，12000rpm离心10min。(4)底层为氯仿相，中层为蛋白相，上层是含RNA的无色水相。将上清转入一新的离心管(注意不要吸入蛋白层)，加入0.5ml氯仿于上清，振荡混匀，室温放置2-3min。4℃，12000rpm离心10m

6、in。(5)将上清转入一新的离心管，加入与上清等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min。4℃12000rpm离心10min，去上清。(6)加入DEPC水配制的体积分数75％乙醇1ml，振摇，洗涤沉淀。4℃12000rpm离心5min。重复步骤(6)一次，以彻底将盐份除净。(7)去上清，真空干燥，用DEPC水溶解。注意：所有待用的非Tris的试剂用0.1%DEPC水溶液配制。离心管、枪头、研钵及玻璃器皿等用0.1%DEPC水处理过夜后121℃高压灭菌20min。提取过程中要勤换手套及戴口罩，以免R

7、NA降解。(8)RNA样品OD值检测。取1μlRNA溶液加入到69μlDEPC处理水中，用紫外分光光度计测定230nm、260nm和280nm的OD值。RNA浓度＝OD260×核酸稀释倍数×40/1000(μg/μl)去除蛋白指标：OD260/OD280≥1.8去除盐分指标：OD260/OD230≥2.0(9)RNA电泳检测。取5μlRNA样品加4μlDEPC处理水和1μl10×Buffer凝胶电泳上样缓冲液，混匀后上样，进行电泳。(10)mRNA纯化采用Oligotex-dT30进行

8、纯化。3.构建寄生虫cDNA文库构建实验采用的载体为pBluescriptIISK(+)，根据选择的EcoRI和XhoI酶切位点和锚定引物。3.1cDNA第一链的合成（1）模板RNA（Poly(A)+RNA）5.00μg中加入不含RNA酶的灭菌水，使其总量达到10.8μl。（2）65℃加热5分钟后，冰中放置5分钟（冷却)。（3）在微量离心管中配制下列反应液。试剂体积/μl5×1stStrandSynthesisBuffer1stStranddNTPMixtureRNa