特异性靶向乙型肝炎病毒x基因的人工转录因子的构建

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1、重庆医科大学硕士学位论文特异性靶向乙型肝炎病毒X基因的人工转录因子的构建姓名：李鑫申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：吴忠均201205重庆医科大学硕士研究生学位论文特异性靶向乙型肝炎病毒X基因的人工转录因子的构建1摘要目的：设计出一种新型的人工转录因子(artificialtransc“ptionfactor，ATF)，使其能够特异性结合于乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBv)X基因启动子区域的靶序列，通过下调X基因来干扰和抑制HBVDNA的正常的复制和表达，为乙型肝炎的基因治疗提供实验依据。方法：(1)通过生物信息学工具获取人工锌指

2、蛋白(zincfingerprotein，ZFP)氨基酸序列，经过密码子优化后构建重组质粒pEGFP—N1一ZFP，将其转染COS-7真核表达细胞，通过观察绿色荧光蛋白的表达、RT-PCR和Westernblot检测其在真核细胞中的表达；(2)构建含有ZFP结合结构域和KRAB效应结构域的ATF，将其转染COS-7真核表达细胞，通过RT—PCR和Westernblot检测其在真核细胞中的表达；(3)将pcDNA3．1(+)一ATF转染HepG2．2．15细胞，通过酶联免疫法ELISA、细胞免疫组化、荧光定量方法、RT-PCR等方法检测其对HBVDNA复制和

3、表达的抑制作用。结果：(1)成功构建了pEGFP—N1-ZFP重组质粒，并验证其在COS-7细胞中的表达；(2)成功构建ATF，并验证本课题由国家自然科学基金(81171562)资助重庆医科大学硕士研究生学位论文其具有相应的生物学活性；(3)成功验证了重组质粒pcDNA3．1(+)一A_TF能够抑制HepG2．2．15细胞内HBVDNA的复制和表达。结论：针对HBVX基因靶序列设计出来的ATF能够抑制HepG2．2．15细胞内HBVDNA的复制和表达。关键词：人工转录因子：锌指蛋白：乙型肝炎病毒x蛋白：乙型肝炎病毒：HepG2．2．15细胞CONSTRUC

4、TIONOFARTIFICIALTRANSCRIPTIONFACTOROFSPECIFICBINDINGTOXGENEPROMOTEROFHEn姐ITISBVIRUSABSTRACTOBJECTIVE：TodesignanovelartificialtranscriptionfactorofspecificbindingtoXgenepromoterofhepatitisBvirus，whichcoulddecreasetheexpressionofHBVXgenetoinhibitethereplicationandexpressionofHBVDNAi

5、IlHepG2．2．15cells．ThestudywillprovidetheexperimentsbasisforgenetherapyofhepatitisBvirus．METHODS：(1)ZFPgenewassynthesizedandclonedintopEGFP．N1plasmidstoconstructtherecombinantplasmidspEGFP．N1-ZFP．RecombinantplasmidsweretransformedintoCOS．7cellsandtheexpressedEGFPwasobservedunderflu

6、orescentmicroscopeandtheZFPexpressionwasdetectedbyRT-PCRandWesternblot．(2)ATFwasconstructedsuccessfully,containingaDNA—bindingdomainofZFPandafunctionaldomainofKRAB．(3)RecombinantplasmidsweretransformedintoHepG2．2．15cells，detectedtheefficiencyofsuppressionofthereplicationandexpress

7、ionofHBVDNAbyELISA、immunocytochemistry、RT-PCR．RESULTS：(1)Recombinanteukaryoticexpressionvectorsof4重庆医科大学硕士研究生学位论文pEGFP--N1·-ZFPwereconstructedandexpressedsuccessfullyincos7cells．(2)ATFwasconstructedsuccessfullyandwhichcouldexpressnormallyineukaryoticcells；theEMSAresultsdemonstrate

8、dthatATFcouldbindspecificallytoHB