乙型肝炎病毒基因(s、x)载体构建表达及功能研究

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1、重庆医科大学硕士学位论文乙型肝炎病毒基因（S、X）载体构建表达及功能研究姓名：王丹申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：胡怀东201205重庆医科大学硕士研究生学位论文乙型肝炎病毒基因(s、x)载体构建表达及功能研究摘要目的分别构建乙型肝炎病毒(HepatitisBⅥnls，HBV)S基因(包括Pre—S1，Pre—S2和S)和X基因的带FLAG标签的真核表达载体，并进行有效表达，进而通过高通量蛋白质技术获取与X蛋白相互作用的蛋白质复合物，以期为进一步研究乙型肝炎病毒外膜蛋白及X蛋白的功能打下基础。方法以

2、质粒pcDNA3．1．HBV为模板，通过PCR技术扩增HBV基因组Largesurfacea11tigen(LS)、MiddlesurfaceaIlⅡgen(MS)、Smallsurfaceantigen(SS)和X基因片段；将PCR克隆获得的目的基因片段分别插入真核表达载体pCMV-ta92B，构建重组质粒pCMV_ta92B—LS、pCMV-ta92B-MS、pCMV-ta92B-SS和pCMV-ta92B—X，并送测序鉴定。将鉴定正确后的目的基因表达载体分别转染293FT细胞，Westemblot检测

3、其表达。继而应用FLAG亲和层析柱分离HBX复合体，iTRAQ标记后用串联质谱对其进行鉴定。选择三次实验中只在HBX复合体中鉴定的蛋白质作为进一步功能分析的侯选蛋白。通过免疫共沉淀和免疫共定位，进一步确认侯选蛋白1本课题由国家自然科学基金(批准号：No30930082．30771923，81171560)，国家科技重大专项(批准号：No2008zxloOo芝一006，2012zxlo002007)，教育部长江学者和创新团队发展计划(批准号：No．IRT0872)资助。2重庆医科大学硕士研究生学位论文G6PD

4、与HBV-x蛋白相互作用。结果分别用相应内切酶酶切重组真核表达载体pCMV-ta92B-LS、pCMV-ta醇B-MS、pCMV-ta92B-SS和pCMV-ta92B—X，各切出两个片段，大片段大小与pCMV-ta92B空质粒大小一致，小片段大小分别与对应目的基因片段LS、MS、SS和X大小一致，且测序结果表明，重组真核表达载体分别含有相应的完整的目的基因片段。Westemblot检测结果表明，转染了表达载体pCMV-ta92B—LS、pCMV_ta92B—MS、pCMV-ta92B—SS和pCMV-ta

5、醇B—X的293FT细胞分别在43KDa、34KDa、24KDa和17Kda处各出现了强反应条带。空白对照均未见相应条带出现。应用FLAG亲和层析柱，成功的分离出HBx复合体，iTRAQ标记后用串联质谱对其进行鉴定。三次实验中，58个只在HBX复合体的蛋白质得到鉴定，包括G6PD。通过免疫共沉淀和免疫共定位，明确侯选蛋白G6PD与HBx蛋白存在相互作用。结论成功构建乙型肝炎病毒S基因和x基因的真核表达载体pCMv-ta92B—LS、pCMV-ta92B—MS、pCMV．ta92B-SS和pCMV-ta92B

6、．X，并能正确表达。同时成功的分离并鉴定出HBx复合体，明确了侯选蛋白G6PD与HBx蛋白存在相互作用，为进一步研究乙型肝炎病毒X蛋白和外膜蛋白的功能打下基础。1重庆医科大学硕士研究生学位论文关键词：外膜蛋白，x蛋白，乙型肝炎病毒，真核表达载体，G6PDCoNSTRUCTIONANDEXPRESSIONOFTHEPLASMIDSEXPRESSINGHBVGENE(S、X)ANDFUNCTIoNoFTHEGENESABSTRACTObjec小eToconstnlcttheeuk哪oticeXpressionp

7、lasmidsoft11esgenea11dxgeneofHBV’距dtocaptureandconjfimt11eproteinsmteractedwithHBx．MethodsThegene仃agmentsofLargeSurfaceantigen、MiddleSurfaceantigen、SmallSurfaceantigenaIldXofHBVwere锄plifiedbyPCR．ThenthetargetDNA仃a舯entswereinsenedintoeuka眄otlcexpressionvect

8、orpCM、厂_ta92BseparatelytoconsmJct也erecombm锄tplasmidspCMV_ta92B．LS、pCMV．ta92B-MS、pCMV-ta92B—SSaIldpCⅣ【V．ta92B—X；ment11erecombinantplasmidsweresequenced·ARersequencingalldcon缸mation，thetargetplasmidspCMv-ta92B-