乙型肝炎病毒对核转录因子nrf2表达影响的研究

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1、万方数据中图分类号幽兰：垒垒UDC＆iQ硕士学位论文学校代码!Q53三密级公珏乙型肝炎病毒对核转录因子Nrf2表达影响的研究EffectofHepatitisBVirusOilNuclearerythroid2．．relatedfactor2作者姓名：学科专业：研究方向：学院(系、所)：指导教师：唐伟临床医学内科学感染病学湘雅二医院蒋永芳副教授论文答辩日期垒叫答辩委员会主劈毒兰p中南大学二零一四年五月万方数据硕士学位论文原创性声明学位论文原创性声明掣IlllIl2MIl6IIIIIl8IIil5lIIIIl8IIII《3川0㈣本人郑重

2、声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他入已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。作者签名：日期：盟年』月丑日学位论文版权使用授权书本学位论文作者和指导教师完全了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定：即学校有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版；本人允

3、许本学位论文被查阅和借阅；学校可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其它手段保存和汇编本学位论文。保密论文待解密后适应本声明。作者签名：2鍪在日期：上业年j旦日导师签名日期：么华年互月孕日万方数据硕士学位论文中文摘要摘要背景和目的：乙型肝炎病毒(HBV)感染呈世界性分布，我国是HBV的高流行地区，一般人群中流行率为7．18％，大概有9300万慢性乙型肝炎患者。慢性HBV感染可以导致肝脏慢性炎症坏死和纤维化，甚至可发展为肝硬化及肝细胞癌，对患者造成极大危害。氧化应激反应是肝细胞炎症坏死、纤维化甚至肝

4、硬化及肝癌发生发展过程中的重要机制之一。慢性HBV感染的肝细胞持续表达病毒蛋白可以引起肝细胞线粒体释放过量的活性电子和活性氧自由基，导致肝细胞脂质过氧化和DNA损害，从而造成肝细胞的损伤。核转录因子Nrf2作为抗氧化应激基因的调控者，在抗氧化应激反应中促进多种抗氧化蛋白的合成而发挥重要作用，它激活多种抗氧化蛋白如NQ01，HO一1等，能够减轻肝细胞所受的氧化损害。在对酒精性肝炎、非酒精脂肪肝、药物性肝炎等的临床研究发现Nrf2的上调可以减轻肝细胞所受的氧化应激损害。但HBV对Nrf2表达影响的研究报道很少，并且作用机制也不清楚。在本研

5、究中，我们通过研究HBV质粒转染HepG2细胞及慢性乙型肝炎患者肝组织，观察HBV对Nrf2mRNA和蛋白质表达的影响，为慢性乙型肝炎病变机制提供实验基础。方法：1．质粒转染：将HepG2细胞种植于6孔板，当细胞生长达培养皿70％时，分别用pcDNA和pHBV质粒转染HepG2细胞，转染后4小时更换培养基1次，继续培养48小时收集细胞进行后续实验。1T万方数据硕士学位论文中文摘要2．实时定量聚合酶链式反应：首先分别提取已经转染质粒的HepG2细胞的总RNA，测定RNA的浓度后取2ugRNA，在逆转录酶作用下合成cDNA，然后行Real

6、timePCR。3．蛋白免疫印迹法：以fl-actin为内参照使用蛋白免疫印迹法检测Nrf2蛋白的表达。4．免疫组织化学法：用免疫组织化学方法检测慢性乙型肝炎患者肝活检病理组织中Nrf2蛋白的表达，并且观察轻度、中度及重度炎症坏死肝组织中Nrf2蛋白的表达。结果：1．用RT-qPCR法检测Nrf2mRNA的表达，以fl-actin为内参照。结果表明HBV质粒转染组Nrf2mRNA的相对表达量与空载体组和未转染组表达相似，说明HBV对Nrf2mRNA的转录水平无上调作用。2．用Westernblot法检测Nrf2蛋白的表达，以p-act

7、in为内参照。结果表明HBV质粒转染组能够表达HBx蛋白，空载体组和未转染组无表达。说明HBV转染组质粒转染成功。空载体组和未转染组中Nrf2表达量基本一致，而HBV质粒转染组Nrf2的表达量明显高于前两者。表明HBV可以上调Nrf2蛋白的表达。3．用免疫组织化学法检测慢性乙肝患者肝活检病理组织中Nrf2蛋白的表达。结果显示慢性乙肝患者Nrf2蛋白的表达量明显高于正常组。轻度炎症坏死肝组织中Nrf2的表达量最高，中度炎症坏死肝组织中Nrf2的表达量次之，重度炎症坏死肝组织中Nrf2的表达量最低。说明HBV感染能够上调慢性乙型肝炎患者肝

8、组织Nrf2蛋白的表万方数据硕士学位论文中文摘要达，但是持续HBV感染可以下调Nrf2蛋白的表达。结论：1．HBV表达质粒成功转染至HepG2细胞中，并且可以上调Nrf2的蛋白表达，HBV对Nrf2mRNA的表达未见上调