sybr green实时pcr检测甲型h1n1与季节性流感病毒方法的建立

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1、需二勉二UDC⋯．兽l堰⋯!薹警⋯刍葺⋯⋯编号⋯⋯一：⋯⋯十南大学CENTRALSOUTHUNIVERSITY硕士学位论文论文题目S塑＆鱼曼塑塞吐￡gB捡塑』里型H!盟!量至堇：眭速壁疸壹友洼趁建童学科、专业!造瘗医堂研究生姓名奎塞递指导教师王睦查塾援中南大学二零一贰年五月一苓一虱，年丑月硕士学位论文SYBRGreen实时PCR检测甲型H1N1与季节性流感病毒方法的建立DevelopingSYBRGreenIReal—TimePCRassayforRapidDetectionofNoVelInfluenzaAH1N1andSe

2、asonalinnuenzavims作者姓名：李文悌学科专业：临床医学学院(系、所)：湘雅医学院医学检验系指导教师：王晓春教授中南大学2012年5月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的科研成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的科研成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：乏萎叁嵫日期：塑堡年』月翻关于学位论文使用授权说明本人了解中南大学有关

3、保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：壁查悔导师签名：日期：垄盟年』月望日硕士学位论文中文摘要摘要目的：建立一种检测甲型HlNl、季节性H1N1、H3N2和乙型流感病毒的SYBRGreenI实时荧光定量PCR法与多重PCR法，并将建立的方法进行初步临

4、床应用。方法：1．设计针对甲型H1N1、季节性H1Nl、H3N2与乙型流感病毒HA基因的引物，分别进行SYBRGreenI实时荧光定量PCR反应，用人的Q心DH基因作为内参判断标本来源和实施质量控制的依据，同时进行熔解曲线和Tm值分析。优化荧光定量PCR的反应体系与反应条件，检测该方法的敏感性，特异性和重复性并进行盲样检测评价实验。2．利用以上四对引物，建立可同时扩增出四个流感病毒特异性片段的多重PCR的方法，并进行敏感性、特异性和盲样检测评价实验。结果：1．SYBRGreenI实时荧光定量PCR构建的荧光定量标准曲线循环阈值

5、与模板浓度呈良好的线性关系，扩增效率为：95．588％，检测灵敏度为101copies／反应，从病毒核酸提取到检测完成需3．5小时，重现性好。该方法与H5、H7、H9亚型流感病毒及副流感病毒1、2、3型均无交叉反应，成功地验证性检验了32份盲样标本。2．多重PCR可同时扩增出流感病毒亚型的HA基因片段长度分别为106bp(甲型HlNl)，135bp(季节性HlNl)，118bp(季节性H3N2)，170bp(乙型流感病毒)。该实验检测甲型H1N1(～colifomi扪7／2009)的灵敏度为102copies／反应。特异性实验

6、结果显示每对引物只检测对应的病毒，32份盲样检测结果特异性好。结论：1．本研究建立的SYBRGreenI实时荧光PCR方法敏感、不需荧光标记探针、成本低及高通量，能用于人类流感病毒的分型检测。2．建立的多重PCR方法可同时检测甲型H1N1及季节性流感病毒，且敏感性和特异性强，可用于基层流感监测部门对人类流感病毒的鉴别分型检测。关键词甲型H1N1，实时PCR，多重PCR，检测方法本课题受以下项目资助：湖南省科技厅项目(20llsk3260)；湖南省出入境检验检疫局科技项目(2009hnk001)；长沙市科技局科技项目(K0904

7、150-11)。中南大学研究生学位论文创新基金(2011ssxt253)。硕士学位论文ABSTRACTObjective：1’odevelopaSYBRGreenIreal．timePCRandamultiplexPCRassaytor印idlydetecth眦annovelH1N1vims，seasonalHlNl、H3N2a11dinflueI嘞Bvims．Method：1．Primersweredesi盟edandselected舶mhiglllvconseⅣedregionsofhemagglut洫m(HA)geneo

8、fthefouriIlnuenzavirus，thefourvims、ⅣeredetectedbvSYBR(heenI-basedreal-timefluorescencepolymerasechainreactionwithmeanalysisofdissociationc