基于rt-pcr方法检测新甲型h1n1流感病毒

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1、基于RT-PCR的方法检测新的甲型H1N1流感病毒一、目的对采集的可疑病例标本进行检测，筛选甲型H1N1流感病毒并排除季节性H1N1流感病毒。二、引物NIC引物引物名称碱基组成目的片段大小备注FluAFluA-M-F30TTCTAACCGAGGTCGAAACG235bp甲型流感病毒M基因通用检测引物FluA-M-R264ACAAAGCGTCTACGCTGCAGH1HAH1F1147AAGAGCACACATAATGCCAT527bpH1N1亚型检测通用引物H1R1673CCATTRGARCACATCCAGHuH1HAH1HAF768ACTACTGGAC

2、TCTGCTGGAAC327bp人季节性流感病毒H1N1亚型检测引物H1HAR1094CAATGAAACCGGCAATGGCTCCSWH1HA-1SW-H1F786AATAACATTAGAAGCAACTGG153bp此次甲型H1N1亚型流感病毒引物SW-H1R920AGGCTGGTGTTTATRGCACCRnasePRnasePFAGATTTGGACCTGCGAGCG约80bp与real-timePCR中RnaseP引物一致RnasePRGAGCGGCTGTCTCCACAAGT三、材料及仪器1、RNA提取试剂盒QIAGenRNeasyMiniKit（

3、catalog#74104）2、β－巯基乙醇（SIGMAβ-MercaptoethanolLot062K0115）3、70%乙醇4、RT-PCRKit：QIAGENOnestepRT-PCRKit（catalog#210212）5、RNasinRibonucleaseInhibitor（Promegacatalog#N2111）6、检测引物7、Axygen1.5mL离心管，货号：MCT-150-C8、Axygen0.2mLPCR管，货号：PCR-02-C9、Axygen10μL，100μL，200μL，1000μL带滤芯枪头10、10μL，100μL

4、，200μL，1000μL加样器11、可调转速14K离心机：12、旋涡混合器：13、生物安全柜：二级生物安全柜14、PCR仪：15、琼脂糖：BiowestAgaroseDistributedbyGeneTech（Shanghai）CompanyLimitedLotNo.10168516、核酸染料：17、电泳液：5×TBE电泳缓冲液catNo.9009032718．电泳槽、电泳仪四、实验步骤（一）RNA提取1、根据标本数量分装RLT液：从Kit中取出RLT液，用1.5mL离心管分装，每管500μL（在体系配制区操作）。2、在生物安全柜内将采样液（鼻拭子

5、、咽拭子、胸水等）或病毒培养物（鸡胚尿囊液或细胞培养液）取100μL加入RLT液管中，充分混匀。3、每管分别加入5μLβ-巯基乙醇，混匀后依次加入600μL70%的乙醇，充分混匀。4、从Kit中取出带滤柱的2mL收集管，打开包装将其做好标记。取步骤（3）中的混合液600μL加入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃收集管中的离心液。5、滤柱仍放回收集管上，将步骤（3）剩余的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃离心液。6、于滤柱中加入700μLWashBufferRW1液，12000rpm，离心15s。7、从QIAGENRNeasy

6、MiniKit中取一支干净的2mL收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μLWashBufferRPE液，12000rpm，离心15s。8、弃收集管中的离心液，再于滤柱中加入500μLWashBufferRPE液，13000~14000rpm，离心2min。9、将滤柱移到一个干净的1.5mLeppendorf管上，向滤柱中加入30~50μL的Rnase-freeWater，室温静置1~3min。10、12000rpm，离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即做实验或-20℃以下保存。注意：BufferRPE使用之间加44

7、mL无水乙醇。（二）反应体系配制1、实验设计：检测标本RNA质控参数：阴性对照：无菌水（标本RNA提取时，跟标本同时提取无菌水。）阳性对照：已知病毒RNA2、PCR反应体系配制（在体系配制区配反应液）1）按下表加入试剂：PCR反应体系组分体积（μL）RNaseFreeWater5×RT-PCRBuffer11.9×n5×n10mMdNTPMixture1×nEnzymeMix1×nRNaseInhibitor0.1×n上游引物0.5×n下游引物0.5×nTotal20×n对每一个建立的反应确定反应数（n=拟进行的PCR管数，包括阴性，阳性对）。考虑到

8、阴性无模板对照，阳性对照，误差，制备过量的反应混合物是必要的。具体如下：（1）如果包括对照，样品的数量（n）