代谢活化系统在人细胞转化模型中的应用

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1、中山大学硕I：论文代谢活化系统在人细胞转化模型-{，的应用代谢活化系统在人细胞转化模型中的应用专业：卫生毒理学硕士研究生：李文学导师：陈雯教授中山大学公共卫生学院中文摘要随着人类社会的发展，越来越多的化学致癌物进入人们的生活，目前致癌物的检测方法存在很多不足，促使人们寻找更加敏感、特异、快速的检测方法。细胞转化试验作为一种化学致癌物检测模型越来越受到人们的重视。通过人为改变人原代细胞中一些癌基因或抑癌基因的表达，能使其逃脱老化而获得永生化。尽管这些永生化细胞获得了无限增殖的能力，但没有获得恶性细胞的表型，在永生化的细胞中继续导入其他的癌

2、基因，最终使细胞发生恶性转化。在转化前的阶段，细胞并没有恶性表型，而是处于逐渐发牛转化的易感状态，处于此阶段的细胞在致癌因素作用下比正常的永生化细胞更容易发生转化。因此，我们选取处于转化前期易感阶段的细胞作为模型，来检测致癌物的致癌活性。本课题组已经证实，处于易感状态的细胞(高表达犀胁川2和c地c的永生化呼吸道上皮细胞)对直接致癌物的敏感性比正常细胞高。说明此细胞转化模型对于直接致癌物的检测有很高的灵敏度。而环境中除了直接致癌物外，绝大部分是间接致癌物，必须经过代谢活化才具有致癌活性。所以细胞转化模型中必须包括一个代谢系统来活化间接致癌

3、物。目前，在致癌活性检测中，S9虽然是经典的代谢系统，但存在很多不足。与S9相比，细胞内的活化系统代谢能力更强，弥补了S9的很多不足。细胞内代谢包括在细胞中高表达特异性代谢酶和诱导特异性代谢酶的表达。我们选择永生化人肝细胞，导入第12密码子突变的肛R鲫癌基因，使其处于恶性转化前的易感状态。采用三种代谢系统：高表达CYPlA2，底物诱导CYPlA2的高表中山大学硕J：论文代谢活化系统在人细胞转化模犁r}1的应用达和S9，选择具有代表性的间接致癌物黄曲霉毒素BI(AflotoxinBl，AFBl)作用于永生化和转化前期细胞株，通过软琼脂克隆

4、形成试验和裸鼠皮下成瘤试验验证在代谢系统的活化下，间接致癌物诱导细胞转化的作用，探讨活化系统在人细胞转化模型中应用的可行性，为间接化学诱变物和致癌物的检测提供稳定、操作简便、灵敏度高、特异度好和更接近人体的活化系统。研究方法1．1RAS高表达细胞株L02．R和ST高表达细胞株L02．RST的建立利用逆转录病毒载体介导的方法在人永生化肝细胞L02的基础上构建癌基因麒R口s川2(V12，第12密码子突变)高表达的细胞株L02．R，免疫印迹检测RAS蛋白的表达。为了提供与L02．R基因背景接近的阳性对照细胞，L02．R中导入SV40的小T抗原

5、(SV40smaUantigen，ST)。通过绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)的表达检测ST的蛋白表达。通过形态学观察、绘制生长曲线以及恶性转化试验观察所构建细胞株的生物学特性。1．2．三种代谢系统的建立和评价1．2．1S9代谢活化系统的制备和检测多氯联苯(Polychlorinatedbiphenyls，PCBs)诱导大鼠，常规方法制备S9，BCA法测定S9的蛋白含量，Ames试验测定S9的代谢活性。1．2．2高表达CyPlA2细胞株的建立用B锄HI和XhoI酶切pCI也．1-TOPO—CYPlA

6、2，得到CYPlA2，连接到逆转录病毒载体pMIG上，获得pMIG．CYPlA2质粒。用逆转录病毒pMIG—CYPlA2表达载体在L02一R的基础上建立高表达CYPlA2的细胞株L02．RA。免疫印迹测定CYPlA2蛋白的表达，P450．GLOTM试剂盒测定CYPlA2的酶活性。1．2．3AFBl对L02细胞中CYPlA2的诱导效应用0．1“MAFBl诱导48小时后换成新鲜培养基继续维持培养到96小时，分别在诱导的24、48、72和96小时测定CYPlA2的表达，来确定诱导效应最强的时间点。用免疫印迹测定CYPlA2的表达，P450一G

7、LO刑试剂盒测定CYPlA2的酶活性。巾山大学颂Ij论文代谢活化系统在人细胞转化模犁11l的应用AFBI诱导细胞转化实验1．3．1AFBl染毒浓度的确定：在相同的染毒浓度下，测定三种代谢系统活化AFBl所引起的细胞毒性。选择其中毒性最大的IC50的50％、20％和5％作为染毒剂量。1．3．2细胞转化试验每周染毒一次，连续染毒四次。染毒后第5周开始每隔两周做一次软琼脂试验，直至阳性结果出现；连续两次软琼脂试验出现阳性结果后进行裸鼠皮下成瘤试验。结果2．1RAS和ST高表达细胞株的建立免疫印迹检测RAS蛋白表达的结果显示L02．R的RAS表

8、达比对照细胞升高约5倍。L02．RST荧光蛋白的表达效率较高，达到80％。与L02相比，L02一R和L02．V在形态上没有明显改变。L02．RST细胞体积变大，失去了原来的多角形形态，出现局部重叠生长的现象