高表达sirt2人脐带间充质干细胞移植对app+鼠的抗衰老作用及机制研究

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1、Amesis(dissertation)submittedtoZhengzhouUniversityforthedegreeofMasterAnti—agingeffectandmechanismresearchunderlyingintravenoustransplantationofSirt2Over-expressioninhumanumbilicalcordmesenchymalstemcellsforAlzheimer’SdiseaseintransgenicAPP+miceByYuanboCuiSupervisor：Prof．FangxiaGuanCellBi

2、ologyDepartmentofBioengineeringMay2014原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：翟夕搠彩簪日期咖r午年厂月列同学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允

3、许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。学位论文作者：崔劲觑日期沙峰年厂月)f日摘要阿尔兹海默病(AD)是一种衰老相关疾病，APP+转基因鼠模型能良好模拟AD的临床特征。AD的主要表现为进行性学习记忆能力减退、空问认知功能障碍以及人格和行为改变等症状。有关间充质干细胞移植治疗APP+转基因鼠的研究比较广泛但其机制尚不明确。Sirt2作为长寿

4、蛋白sirtuins家族成员，可通过调控细胞周期参与营养代谢、衰老及凋亡等多种细胞活动的调节，但其是否可作为治疗神经系统退行性疾病如AD的分子靶标尚无定论。目的通过构建高表达人类沉默信息调节因子2(Sirt2)基因且含有绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)标记的重组腺病毒研究Sirt2基因对人脐带间充质干细胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hUC-MSCs)衰老的影响；并通过体内实验探讨Sirt2高表达的hUC．MSCs移植对APP+转基因模型鼠的抗衰老作用及其作用机制。方法提取hUC—MS

5、Cs总RNA并将其反转录为cDNA，以eDNA为模板进行PCR反应扩增人Sirt2ORF序列，将目的基因插入腺病毒穿梭质粒(pAdTrack—CMV)中构建出阳性重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack．CMV-Sirt2；．PmeI单切使重组穿梭质粒线性化并将其转化进入BJ5183大肠杆菌感受态细胞中与腺病毒骨架质粒(pAdEasyl)同源重组从而获得重组腺病毒载体pAd．Sirt2；PacI单切使重组腺病毒载体pAd．Sirt2线性化，利用脂质体Lipofectamine刑2000将线状pAd—Sirt2重组载体转染至HEK293细胞中扩增和包装出重组腺病毒pAd—Sift

6、2；逐空稀释法测定重组腺病毒滴度。用包装成功的重组腺病毒pad—Sift2感染衰老型P15代hUC．MSCs，以未感染腺病毒的细胞为对照组，CCK．8测定细胞生长曲线，流式细胞术检测细胞周期变化，WestemBlot检测衰老相关基因P21、P16、P53、PCNA、摘要Sirt2的表达变化；最后用重组腺病毒pad．Sirt2感染P3代hUC．MSCs获得感染组细胞，收集感染组细胞并将其移植进入APP+转基因模型鼠体内，三周后采用Morris水迷宫法检测模型小鼠学习记忆能力变化，TBA法检测血清丙二醛(MDA)含量、羟胺法检测血清超氧化物歧化酶(SOD)活性变化，实时荧光定

7、量PCR(qRT-PCR)检测衰老相关基因P21、P16、P53、PCNA、Sirt2的mRNA表达变化，WesternBlot检测衰老相关基因P21、P16、P53、PCNA、Sirt2的蛋白表达变化。结果l、P2和P15hUC．MSCs中Srit2的表达存在差异，与P2代细胞相比，P15代细胞Sirt2基因表达明显降低。2、利用重组腺病毒包装系统，成功构建pAd—Sirt2重组腺病毒载体，并包装、扩增包含人Sirt2基因的重组腺病毒pAd．Sirt2，获得滴度约为1．8×1011pill／L的病毒上清。3、重组腺病毒感染P