高产人参皂苷糖基水解酶菌株的筛选、发酵及初步纯化工艺研究

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1、分类号：密级：学校代码：10165学号：2011111墅遣掌研耗大学硕士学位论文高产人参皂苷糖基水解酶菌株的筛选、发酵及初步纯化工艺研究作者姓名：学科、专业：研究方向：导师姓名：孙晓雨微生物学微生物生化谢明杰教授吕国忠教授2014年O3月学位论文独创性声明／I／ll／l／il／l／I／／譬／fllll，l／／／ll；ll氍12／／I／12／B7／I／／J本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。论文中除特别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或发表过的研究成果，其他同志的研究成果对

2、本人的启示和所提供的帮助，均已在论文中做了明确的声明并表示谢意。学位论文作者签名：豸0二区瘦盈学位论文版权的使用授权书本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定，及学校有权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查阅和借阅。本文授权辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库并进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。保密的学位论文在解密后使用本授权书。学位论文作者签名：丕l二豆墅盈指导教师签名：习至!

3、闺互签名日期：】Df牛年‘月弓日辽宁师范大学硕士学位论文摘要从人参根内分离获得的两株真菌(CGMCCNo．4315、CGMCCNo．4316)均具有将人参二醇类皂苷Rbl专一转化生成人参皂苷Rd的活性，但二者发酵转化效率和产酶能力并未确定。本文为了寻找高活性、高产率、对人参皂苷特定糖基具有高度水解能力的菌株，进行了人参皂苷糖基水解酶高产菌株定向筛选、最佳发酵工艺探究、酶及转化产物初步分离纯化、以及人参叶粉末中人参皂苷分离提纯和定性测量的系统性研究，证明了微生物通过发酵产酶转化低活性人参皂苷为高活性稀有皂苷的可能性。通

4、过琼脂块结合TLC斑点比色定性初筛，液体发酵与HPLC联合定量复筛，建立产物准确、快速的分析方法，以最高产酶能力筛选出CGMCCNo．4316菌为产人参皂苷糖基酶发酵和纯化研究的最优菌株。采用TLC酶活测定法，在单因子试验基础上，应用响应面中心组合法则，以人参皂苷糖基酶酶活力为响应值，建立3D及等高曲线数学模型，利用二次多项回归拟合方程对培养基组分各影响因子及关键因素进行发酵优化。结果显示，以麦麸皮20．47g／L为碳源，蛋白胨9．7g／L为氮源，初始pH6．0，瓶装量45mL／250mL，摇瓶转数180r／min，

5、投料量10．00％，30℃发酵72h，其酶活力达至I]92．78U／m【L。在发酵液中酶量达到最大值后，利用硫酸铵和乙醇分级沉淀法对发酵产生的关键酶进行初步分离纯化，获得了以硫酸铵为首选方法的盐析纯化方法。通过萃取联合硅胶层析对转化产物进行分离纯化，Rd被完全分离，转化过程彻底，获得了纯度相对较高的单体化合物。此外，本文利用乙醇加热回流提取辅助大孔吸附树脂纯化技术，对人参叶粉末制品中人参皂苷进行分离纯化研究，并建立了皂苷含量的HPLC测定方法。关键词：CGMCCNo．4316；人参皂苷糖基水解酶：生物转化；发酵优化：

6、分离纯化直主厶叁皇董蕉基盔鲢酶萱选煎篮堡：蕉壁丛塑垄丝丝王茎笪盟宣Screening，FermentationandPreliminaryPurificationTechnologyforAbsidiaglaucaCGMCCNo．4316ProducingGlycosideHydrolaseofGinsenosideAbstractThepatentstrainsofAbsidiagl口．caCGMCCNo．4316andZygorhynchusmoelleriCGMCCNo．4315havetheuniqueabi

7、litytransformginsenosideRblintoRd，whichweremainlyseparatedfromginsengroot．Howevertheirefficienciesinfermentationandenzymeproductioncapacityhavenotbeenclarified．Thisthesisisaimedatscreeninghighlyactivefungalstrainsforginsenosidetransformation，conditionandpurific

8、ationofginsenosidehydrolasedeterminatingoptimimngfermentationThetestofseparationandpurificationofginsenosidesin1eavespowderwasconducted．Theresearchworkconfirmedthecommercial