肾上腺髓质嗜铬颗粒的胞吐特性及nsf在胞吐过程中的作用

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1、上海医科大学硕士学位论文肾上腺髓质嗜铬颗粒的胞吐特性及NSF在胞吐过程中的作用姓名：李志琴申请学位级别：硕士专业：生物物理学指导教师：凌诒萍20000501中文摘要肾上腺髓质嗜铬颗粒的胞吐特性及NSF在胞吐过程中的作用摘要肾上腺髓质细胞是研究神经内分泌细胞受调分泌的一个较好的模型，研究其分泌特性不仅有助于揭示神经内分泌的机制，而且在相关疾病的-临床治疗上亦有重要意义；近年来的研究发现N一乙基M页烯二酰亚胺敏感性融合蛋白(N=ethylmaleimide—SellSitirefusionproteinNSF)是一种在细胞内膜泡转运中发挥重要作用的AT

2、P酶，因其可能是一种促进不同类型细胞分泌的高度保守的蛋白而倍受关注。本实验旨在探讨大鼠肾上腺髓质细胞刺激分泌耦联过程中嗜铬颗粒的胞吐特性，并分析和比较在静息与制动大鼠肾上腺髓质细胞中NSF蛋白分子的分布及NSF的mRNA表达水平的变化，为揭示胞吐的作用机制提供依据。整个实验共分三部分，第一部分利用透射电镜观察了大鼠肾上腺髓质的超薄切片中及冷冻蚀刻复型膜中嗜铬颗粒的分泌特性：嗜铬颗粒主要以胞吐(exocytosis)的方式分泌其内含物，它存在三种不同方式的胞吐：单颗粒胞吐、多颗粒连续胞吐及颗粒内容物通过融合小孔进行胞oi,并观察到在胞吐的不同阶段，胞

3、吐部位的膜结构不断变化的过程。正常大鼠肾上腺素细胞中致密圆形颗粒的数目较内容浅淡的颗粒多(P<0．01)；大鼠制动8h之内以致密圆形颗粒的胞吐为主，在长时间应急制动申(8h-24h)则两种颗粒均发生胞吐。以上的结果提示：这两种不同形态的颗粒可能是同一种分泌颗粒的不同发育阶段。第二部分采用光镜和电镜免疫细胞化学方法对NSF在静息及制动大鼠’净上腺中的分布作了定位研究，结果如下：(1)采用光镜hBC法，可见抗NSF的抗体主要结合在大鼠肾上腺髓质中，皮质为阴性反应；(2)采用免疫电镜技术，发现静息时有些胶金沿嗜铬颗粒膜规则排列，有些聚集于嗜铬颗粒内；在统

4、计的l80个嗜铬颗粒中，有胶金标记的颗粒(包括低、高两组)有78个(43．3％)，在这78个嗜铬颗粒中胶金仅位于颗粒膜上的占39．7％，仅位于颗粒内部的占6．5％，还有53．8％的嗜铬颗粒其膜上及颗粒内部均有胶金沉积：中文摘要一2．制动8h后大鼠的髓质细胞中胶金主要位于嗜铬颗粒膜上，嗜铬颗粒内较少。在统计的188个嗜铬颗粒中，有胶金标记的嗜铬颗粒(包括低、高两组)共l23个(65．4％)，比静息时多(p<0．01)；在这123个嗜铬颗粒中胶金仅位于颗粒膜上的占56．1％，比静息时多(p<0．01)；仅位于颗粒内部的占2．4％，比静息时少(p<0．0

5、1)；剩余的41．5％的嗜铬颗粒其膜上及颗粒内部均有胶金聚集，较静息时少(p<0．01)；制动后嗜铬颗粒逐渐向质膜靠近并与质膜接触，在接触部位标有大量胶金。这些结果提示：(】)NSF很可能在细胞胞吐的多个阶段均发挥作用。(2)嗜铬颗粒内可能是NSF的储存部位。第三部分采用原位杂交技术分析了在静息与制动大鼠肾上腺髓质细胞中NSF的mRNA表达水平的变化。结果如下：在静息状态下，杂交信号多数出现在核内，有些分布于核周胞质中，而皮质为阴性反应；制动8h后，髓质细胞呈强阳性反应，杂交信号多数位于核周胞质中，皮质仍为阴性反应。以上结果表明：大鼠制动后，’肾上

6、腺髓质细胞中NSF的mRNA表达水平增高。综合本实验三部分硎结果：大鼠制动后引发应急反应，髓质细胞中致密圆形颗粒与内容浅淡的颗粒数目均减少，细胞分泌增加，同时，有抗NSF抗体标记的嗜铬颗粒数目上升，NSF的mRNA表达水平增加，说明NSF在肾上腺髓质嗜铬颗粒的胞吐中起着重要的作用。关键词：细胞胞吐IqSF肾上腺髓质CharacteristicsofExocytosisinAdrenalChromaffinCellsandtheRoleofNSFinExocytosisAbstractTheadrenalchromaffincellshavebeen

7、usedasallaccessibleandvaluablemodelforstudyofexocytosis，ThestudyofcharacteristicsofregulatedexocytosisinchxomaffincellsprovidesnotonlyfundamentalknowledgeofneurosecretionbutiSofadditionalimportanceinviewoftherapyoftherelateddiseases．Inrecentyears，intensivestudyofproteinsinvolv

8、edinregulatedexocytosisindicatedthatN—ethylmaleimide．sensitiv