SNAP29分子在胞吐中的功能研究

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1、上海第二医科大学硕士学位论文SNAP-29分子在胞吐中的功能研究姓名：林琳申请学位级别：硕士专业：免疫学指导教师：陆佩华;盛祖杭2003.5.1海第一二医科火学2000级坝士学位论文SNAP-29分子在胞吐中的功能彤l究全文摘要SNARE蛋白是一组在膜与膜的融合过程中起重要作用的蛋白分子，SNARE蛋白之间可以通过相互作用形成稳定的SNARE复合物。神经递质的释放也是通过突触囊泡在突触前膜上的搭靠以及囊泡与前膜的融合来进行的，其中位于突触囊泡上的突触小泡蛋白synaptobrevin／VAMP(v．SNARE)、位于突触前膜上的突触前膜蛋白syntaxin和SNAP

2、一25(t-SNARE)这三者聚合所形成的SNARE复合物在突触囊泡胞吐过程中起着重要的作用。与SNARE蛋白有相互作用的蛋白可以通过调节SNARE复合物的形成与解离来影响突触小泡的胞吐过程，从而调节神经递质的释放。SNAP一29分子是作为一种SNARE蛋白于1998年被发现的。SNAP-29基因全长777bp，编码258个氨基酸，推测分子量为28，970Da，因为它与SNAP-25、SNAP．23有部分同源性，被发现它的实验室命名为SNAP一29。SNAP一29分子内含有两个可以形成c【．螺旋结构域(coiled—coilsdomain)的部位，其中一个q-螺旋结

3、构域符合SNARE蛋白的同构序列。SNAP．29在各种组织上均有分布，在细胞内，它主要位于膜结构上。据文献报导，虽然SNAP．29分子自身缺乏与膜结合的结构，但它通过与多种syntaxin分子结合，从而分布在膜的周围。虽然SNAP·29在膜的运输过程中的功能及其结合特性尚不清楚，但人们普遍认为它是一个无处不在的常见的SNARE蛋白，参与到一般的SNARE依赖的膜的转运过程中。近期有实验证明SNAP．29位于突触上，直接与syntaxinlA结合，与c【一SNAP竞争性结合SNARE复合物，从而通过抑制SNARE复合物的解聚来调控神经递质的释放。本项研究采用国外新近建

4、立的一种对可能调控神经递质释放的蛋白分子进行功能研究的实验方法⋯PCI2细胞分泌分析系统对SNAP一29分子在胞吐中可能起的调节功能做进一步的研究。该系统可以研究各种蛋白在胞吐(exocytosis)过程中的作用。该方法是将编码hGH(人生长激素)的质粒和编码所感兴趣蛋白的质粒瞬时共转染PCI2细胞，在转染后细胞中，hGH可作为胞吐的一个报告物，当PCI2细胞受到刺激后，hGH会分泌出来，感兴趣蛋白对hGH分泌的影响反映了它对胞吐过程起的作用。本项研究首先对PCI2细胞的转染条件进行了优化，分别观察了细胞铺板密度、DNA数量、DNA与脂质体的比例对转染效率的影响。同

5、时采用表达绿色荧光蛋白的商品化质粒载体pEGFP—N3转染PCI2细胞，利用绿色荧光蛋白作为报I二海第二医科大学2000级硕士学位论文SNAP．29分子在胞吐中的功能研究告物来检测PCI2细胞的转染效率，确立了最佳转染条件：6}L板每孔种1．5X106个PCI2细胞，DNA总量为4．5ug，DNA与阳离子脂质体Lipofectamine“2000比率为1：2．5(即脂质体使用11．25ug)。接着又对共转染效率进行了验证，因为共转染效率高低是本项实验的关键。实验采用表达绿色荧光蛋白的质粒pEGFP—N3及表达红色荧光蛋白的质粒pDsRed2．C1共转染入PCI2细胞

6、，利用荧光显微镜及流式细胞仪来观察转染情况，结果发现这两个质粒的确能以很高的频率(几乎可以达到100％)得到共转染。最后通过建立PCI2细胞分泌分析系统，对SNAP一29分子功能进行研究。以pcDNA3．1his质粒为对照组，将GST作为无关参照物，将SNAP一25，syntaxinlA这两个SNARE蛋白作为相关参照物。在与对照组pcDNA3．1His比较后得出以下结论：①过量表达外源性SNAP一25、GST分子对PCI2细胞的胞吐过程没有影响；②过量表达外源性syntaxinlA分子对PCI2细胞中的可调节分泌途径的胞吐起抑制作用(23．6％)(P

7、③过量表达外源性SNAP．29分子对PCI2细胞中的调节分泌途径的胞吐起抑制作用(13．58％)(P<0．05)。通过该功能实验可以推测SNAP．29分子在神经递质的释放过程中有抑制作用，是神经递质释放过程中的一个调控蛋白。这为进一步阐明SNAP．29分子的功能提供了一个有力的证据。}海第二医科又学2000级颤士学位论文SNAP．29分子在胞耻中的功能研究AbstractSNAREproteinsareaseriesofproteinsthatplayallimportantpartintheprocessofmembrane—membranefusion．An