青稞c4h基因的克隆与组织表达分析

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1、万方数据SichuanAgriculturalUniversityMasterDissertationCloningandTissueExpressionAnalysisofHvC4HGeneinQingke(HullessBarley)ByXiaojiaoLuoAdvisor：Prof．ZongyunFengMajor：BiochemistryandMolecularBiologyDirection：PlantMolecularBiologyMay,2014万方数据论文独创性声明IIIIIIIIIIIIIIIIIHIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII

2、If√01219印本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生躲巧，卜崎关于论文使用授权的声明≯口／争年6月乒日本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复

3、制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。Ⅵ么论文不保密。口本论文保密，在一年解密后适用本授权。(请在以上口内划“√”)J口，妒年Z月乒日．扣t≯年《只fB李髻卜j／弘汤名签蜷隧究咖研导万方数据摘要青稞(HordeumvulgareL．var．nudumHook．f)即裸大麦，是营养丰富的粮食作物，不仅富含蛋白质和膳食纤维，更含有黄酮类化合物、Y．氨基丁酸等活性功能成分，其保健和医疗作用一直是大麦工作者研究的重点。黄酮类化合物具有抗氧化、抗癌抗肿瘤、延缓衰老、保护心脑血管等多种药理功能，是人们理想的保健

4、物质，植物中的天然黄酮类化合物主要有黄酮、黄酮醇、黄烷酮、异黄酮等十几类，大麦中的黄酮类物质以黄酮醇为主。苯丙烷代谢途径是植物最重要的次生代谢途径之一，其公共苯丙氨酸途径下游的黄酮支路是植物黄酮合成的重要方式。肉桂酸．4．羟化酶(cinnamate．4．hydroxylase，C4H)是苯丙氨酸途径第二步的关键酶，也被认为是该途径的限速酶，它作为细胞色素P450酶蛋白家族参与苯丙烷代谢途径的第一个成员，高效地催化苯丙烷代谢途径中的第一个氧化反应：在02和NADPH存在下将反式肉桂酸苯环的C4位羟基化生成对．香豆酸。为从分子水平了解青稞黄酮代谢途径相关基因的作用，使

5、用RT-PCR结合同源克隆与RACE技术，用青稞材料“94．19．1”首次克隆出青稞肉桂酸．4．羟化酶(HvC4H)基因的cDNA全长序列，并使用实时荧光定量PCR对其在青稞胚乳发育5个时期里不同组织(子粒、茎部和叶片)中的表达水平进行了相对定量分析。主要结果如下：1．根据NCBI数据库里已知的禾本科单子叶植物C4H基因序列，通过序列比对在保守区域设计一对简并引物，同源克隆得到HvC4H基因的保守片段。在保守片段的基础上，采用RACE技术分别扩增出HvC4H基因的3’端和5’端序列并由序列拼接得到cDNA全长。结果表明，青稞肉桂酸一4．羟化酶基因的cDNA长为19

6、51bp，开放阅读框(ORF)为1518bp(125—1642)，共编码505个氨基酸；5’端非编码区(5’．UTR)为124bp，3’端非编码区(3’-UTR)为309bp并包含了27bp的Poly．A尾。2．Blast序列比对结果显示，HvC4H基因与二穗短柄草C4H基因相似度最高，为94％，与绿竹笋、柳枝稷、慈竹、粟米等C4H基因的相似度在92％，与水稻、玉米、垂尾桉、高粱等C4H基因的相似度在82％以上。HvC4H氨基酸序列包含了其CYP450酶蛋白家族已知的保守域和特征基序，包括血红素结合域、5个特征性底物识别基序、万方数据脯氨酸铰链基序等，同时也识别到

7、C4H区别于其它CYP450蛋白的特有的氨基酸活性位点。3．采用实时荧光定量PCR技术，以在大麦胚乳发育期表达稳定的13-actin和a-tubulin基因为内参，检测了HvC4H基因在青稞胚乳发育5个时期里子粒、茎部和叶片中的表达水平。结果显示，HvC4H基因在青稞胚乳发育各个时期的子粒、茎部和叶片中的表达存在明显的组织和时空差异性。茎部中的表达量刚开始最高，4天后急剧降低；叶片中的表达量在第8天达到最高；子粒中的表达量不高，但每个时期的差距较小。总的看来，在整个胚乳发育期，茎中HvC4H基因的表达量相对较高，而子粒中HvC4H基因的表达较低但保持稳定水平。关键

8、词：青稞(