重组蛋白cfr的单克隆抗体制备及初步应用

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1、万方数据论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包含其他个人或集体己经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：乃(1『年6月(b日，关于论文使用授权的声明本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送

2、交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。口本论文不保密。口本论文保密，在年解密后适用本授权。(请在以上口内划“√”)研究生签名：脚招引雅哆名I／功／V∥乜仞c’p年(月乒日乃厂丫年石月Co日万方数据本研究受“十二五国家科技支撑计划一食品安全风险评估关键技术研究"项目(2012BAK01BOO)资助。万方数据摘要Cfr蛋白是由c痧基因编码的甲基转移酶，它能与多种

3、药物作用的靶点结合从而介导五类药物耐药。在不同国家、地区的人源和动物源细菌中均发现了咖基因，其携带率有逐年增加的趋势，它的出现和流行给临床医学和公共卫生学带来了潜在的危害，引起了人们的高度关注。目前c痧基因阳性菌的监测方法主要是普通PCR法，但监测的结果只能表明该细菌是否含有咖基因，而无法确定c∥基因是否表达了Cfr蛋白，无法进一步为合理用药和风险评估提供依据。因此，从免疫学方面探索建立对Cfr蛋白的监测方法就显得十分重要。通过制备重组蛋白Cfr的单克隆抗体；再以制得的单抗为一抗，用Wester

4、nblot方法对临床肠球菌进行检测，达到为建立监测驴基因阳性菌的免疫学方法提供理论依据的目的。本研究以实验室保存的纯化的重组蛋白Cfr为免疫原，对BALB／c小鼠进行免疫。初次免疫时将弗氏完全佐剂与抗原60pg(50pg一100lag均可)进行等体积混合，充分乳化后，再皮内分点注射；一个月后对小鼠进行加强免疫，其抗原量、注射体积均不变，但改为用弗氏不完全佐剂和皮下注射的方式；此后每间隔两周加强免疫一次，四免后分离小鼠脾细胞与SP2／0细胞进行融合，并用HAT选择性培养基进行培养(用小鼠腹腔巨噬细

5、胞作为滋养细胞)；以纯化的重组Cfr蛋白为包被原，用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清，将选出的阳性杂交瘤细胞进行克隆化培养；经过三次及以上亚克隆后成功获得了1株能够稳定分泌针对重组蛋白Cfr的高效价单抗的杂交瘤细胞克隆(Cfr．D9)。通过检测发现这株单抗能特异性的结合重组蛋白Cfr，并且有较高的效价(腹水效价1：243000)。亚类鉴定结果表明这株单抗的亚类为IgG2a。以制备的单抗为一抗，用Westernblot的方法对16株临床阳性肠球菌和5株临床阴性肠球菌进行分析。结果表明，制备

6、的单抗能特异性的识别临床阳性肠球菌菌株中的Cfr蛋白；还发现在用等蛋白量进行检测的情况下，16株阳性肠球菌的着色带有粗有细，推测临床阳性肠球菌菌株在同样的表达条件下，细菌所表达的Cfr蛋白量有差异。另外，还发现阳性肠球菌菌株所表达的Cfr蛋白量与菌株的不同地区来源、不同的分离部位、不同的克隆型没有直接的关系。但目前还没有从分子机理方面对上述情况进行研究。综上所述，成功制备了单克隆抗体；并以该单抗为一抗，用Westernblot方法成1万方数据功对2l株临床肠球菌菌株进行了检测，证明了实验制得的单

7、克隆抗体有比较好的特异性。实验初步建立了用Westernblot方法来检测临床菌株表达的Cfr蛋白，为探索建立更多的免疫学方法来监测临床菌株中的Cff蛋白提供了理论依据。关键词：Cfr蛋白；单克隆抗体；Westernblot；肠球菌；万方数据AbstractCfrproteinisencodedby旷genemethyltransferase，itcancombineavarietyofdrugtargetstomediatefivekindsofdrugresistance．驴genewasf

8、oundinHumanandanimalresourcesofbacteriaindifferentcountriesandregions，whichincreasetherateyearbyyear,itsemergenceandprevalencecauseclinicalmedicineandpublichealth’Spotentialhazardsandhighattention．Currently,waystOmonitorcUrgene—positivebacteriaistheo