晚期氧化蛋白产物单克隆抗体的制备和初步应用

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1、中文摘要然而，目前检测组织中AOPP水平尚缺乏理想方法。检查外周血AOPP则通常采用比色分析法以340rim处吸光度值以反映标本中AOPP水平，这是基于AOPP结构含双酪氨酸，在酸性条件下于340nm处有一特异吸收峰。此法虽然简便，但易受血脂、纤维蛋白的干扰而影响其准确性；且不能用于对病变组织或细胞中的AOPP定位。我们拟建立免疫学检查方法克服上述缺点。采用体外次氯酸修饰的白蛋白作为抗原，成功制备了特异性识别AOPP的单克隆抗体，通过WesternBlot、免疫组织化学染色首次证实单抗识别血清和沉积于肾脏中的AOPP，初步建立双单抗、单多抗及多单抗夹心EL

2、ISA法鉴定人工制备的AOPP，为深入研究AOPP这种内源性致病分子提供了必要工具。此外，我们利用噬菌体肽库筛选技术对AOPP模拟表位进行了初步探讨。第一章特异性识别天然AOPP单克隆抗体制备和鉴定以次氯酸(HOCI)氧化不同种属血白蛋白(包括人血清白蛋白HSA、小鼠血清白蛋白MSA、牛血清白蛋白BSA、兔血清白蛋白RSA)和人纤维蛋白原、人IgG、人低密度脂蛋白(LDL)，按蛋白：HOCl摩尔比为1：140等体积混合，室温放置30分钟。制备的AOPP在PBS中透析24小时，除去游离的HOCI。AOPP含量通过测定酸性条件下340nm的吸光度，以氯胺T为标

3、准测得。用AOPP．MSA为免疫原加佐剂免疫BALB／c小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(NS．1)融合，按常规方法制备杂交瘤。以AOPP．HSA为抗原包被酶标板，并以未氧化正常HAS做平行筛选以排除与正常蛋白的交叉反应。间接ELISA鉴定筛选特异性识别AOPP—HSA的杂交瘤克隆，所获两株命名为3F2和4C5；扩大培养后制备腹水，用辛酸硫酸铵沉淀法、HItrapProtein和层析柱从腹水中纯化抗体。抗体类别鉴定显示3F2为IgGl，4C5为IgG2a。问接ELISA结果显示2株单抗均能与不同种属来源的氧化型白蛋白(AOPP．HSA、AOPP—BSA、AO

4、PP．MSA、AOPP．1ISA)、HOCI．人纤维蛋白原、n硕士学位论文HOCI一人IgG、HOCl．LDL特异性结合，而与未氧化蛋白及Cu2+氧化的LDL、糖基化蛋白均无交叉反应。竞争ELISA鉴定表明这两株单抗分别识别AOPP不同位点。WesternBlot结果显示，在变性与非变性条件下，3F2可特异性结合人工制备的AOPP—HSA、HOCl一IgG、HOCI．人纤维蛋白原。单抗3F2亦可识别天然血浆与组织中的AOPP。能在一定程度上区分血液透析患者和正常人血浆中AOPP含量的差别以及慢性肾衰患者透析前后血浆AOPP含量的不同。免疫组织化学法检查显示

5、3F2可特异性结合沉积于大鼠模型及各种慢性肾脏病患者肾组织中的AOPP，这种结合可被外源AOPP阻断。此外，3F2可阻断AOPP诱导小鼠单核细胞株RAW264．7细胞胞内氧化反应簇(ROS)生成。第二章建立双抗体夹心ELISA检测血浆AOPP的尝试以HltrapProteinG柱纯化抗体3F2和4C5，纯度达95％以上并按照操作流程标记生物素。分别以双单抗、多单抗夹心、单多抗夹心ELISA方法检测人工制各的AOPP并进行了体系的优化。在抗体包被浓度为l¨酌【Ill，封闭液为0．25％酪蛋白，洗液与抗体稀释液均为0．5％PBST，检测抗体浓度为0．599／m

6、l时即可良好检测标准品。之后，我们又试用了竞争ELISA的方法，以人工制备的AOPP—HSA1．251-lg／ml包被酶标板，倍比稀释AOPP-HSA(0-499／m1)、慢性肾衰患者、健康成人血清与0．599／mlBio．3F2等体积混匀后加入板孔中，最后加入HRP．亲和素。标准曲线的拟合度良好，而且各种抗体组合的双夹心ELISA均可特应性地检出人工体外制备的AOPP，且敏感度可达ng／ml水平但是肾衰患者与正常人的测定值之间没有统计学意义。因此又尝试用敏感性更强的时间分辨荧光检测法检测患者血清AOPP，按照普通夹心ELISA的条件摸索，即以4C5l“幽

7、_Ill包被酶标板，酪蛋白封闭后，加入不同浓度的标准品AOPP．HSA，反应30min后加入Bio一3F20．5I_tg／ml，30min后加入铕标记的亲和素，15min后加入增强液，37℃反应5min后多功能酶标仪测值。所建立的标准曲线已经符合临床检III中文摘要测的需要，但是在血清样本的检测上面，还是存在一定的问题，最佳的包被与检测条件还要改变。第三章AOPP表位模拟序列的筛选鉴于已确定的自然和人工制各的AOPP均为在体内外次氯酸氧化的白蛋白、脂蛋白或其他蛋白，即已形成非天然抗原表位。本章工作的目的旨在探索体内是否有自然存在的类似于AOPP表位的序列，

8、如果存在，将会对机体产生何种影响。我们以亲和层析纯化的抗AOPP多