细胞珠蛋白在肝纤维化中抗氧化应激的分子机制

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1、南方医科大学2011级硕士学位论文细胞珠蛋白在肝纤维化中抗氧化应激的分子机制Molecularmechanismsofanti—oxidativestressofCytoglobininliverfibrosis课题来源：广东省科技重点资助项目(20108031500014)专业名称学位申请人专旨导教师答辩委员会主席答辩委员会成员论文评阅人免疫学邹珊珊董文其教授朱家勇教授高尚先教授余新炳教授何庆瑜教授郑磊教授陆家海教授吴英松教授2014年5月10日广少I硕士学位论文细胞珠蛋白在肝纤维化中抗氧化应激硕士研究生：邹珊珊

2、指导教师：董文其摘要由于生活水平日益提高，饮食结构的变化和预防保健措施的相对滞后，肝纤维化已经成为一种全球性病症，尤其我国，其发病率有明显增高的趋势。肝纤维化研究的重要性在于：(1)肝纤维化是各种肝病发展成肝硬化的必经病理过程；(2)肝纤维化是阻止发展肝硬化过程中唯一可靠的治疗时机；(3)世界范围内对慢性肝病治疗的两大策略即抗病毒治疗和阻止肝纤维化的发生。目前，尚无特效抗病毒疗法治疗慢性病毒性肝炎。因此，肝病的治疗重点转移到如何防止肝纤维化以致肝硬化的发生、发展方面，随之而来的是对肝纤维化发生机制的研究。肝纤维化是

3、由各种致病因子如酒精、乙肝病毒等所致肝内损伤组织修复过程中的代偿性反应，表现为肝脏内纤维结缔组织的细胞外基质(Extracellularmatrix。ECM)过度沉淀。肝星状细胞(Hepaticstellatecells，HSC)的活化和增殖是肝纤维化形成的中心环节。肝细胞损伤的其中一个重要机制是由于细胞受到外源或内源性刺激产生的氧化应激(oxidativestress，os)，导致细胞内活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)过度产生，与膜磷脂的多不饱和脂肪酸发生氧化反应形成脂质过氧化物(1i

4、poperoxides，LPO)。LPO可直接损害细胞膜并导致细胞死亡，并且可抑制抗氧化系统，削弱细胞防御机制。最重要的是其可激活HSC细胞，诱导HSC产生大量胶原蛋白，促进肝纤维化的发生。几乎所有临床和实验性肝纤维化都被证实与氧化应激有关，而抗氧化剂可以减慢或阻止肝纤维化的发摘要展。细胞珠蛋白(Cytoglobin，Cygb)作为一种细胞内抗氧化蛋白，是最初由日本Tawada等在2001年在大鼠纤维化肝脏的星状细胞内发现了此种蛋白。其基因定位于染色体17q25，含有4个外显子和3个内含子，编码190个氨基酸残基，

5、分子量20．9KDa，拥有经典的螺旋三明治折叠结构。由于其紧凑的螺旋形结构和结合血红素的能力，Cygb可可逆的结合各类气体分子，如氧气、一氧化氮等。Cygb在缺氧时表达上调且特定地表达在毛细血管周围，提示其可能具有氧感受器的作用。Cygb可作为清道夫，清除组织缺血后再灌注时产生的ROS和NO分子。此外，Cygb具有过氧化氢酶活性，在肝星状细胞中起过氧化物清除剂的作用。最近有研究显示，Cygb对肝纤维化的逆转有着非常显著的作用。由本实验室构建的肝纤维化大鼠模型中，注射了Cygb的治疗组与未注射Cygb的对照组相比，前

6、者纤维化肝脏组织有了明显的逆转。研究证明Cygb作为一种源于人体大部分内脏器官的正常蛋白，其毒副作用小，在抗肝纤维化的临床治疗中将占有重要地位。因此，本研究着重于研究Cygb在肝纤维化中抗氧化作用的分子机制从而找到其治疗肝纤维化的具体信号通路。有研究显示Cygb广泛分布各脏器中，主要表达于结缔组织成纤维细胞中，如肝星状细胞、成软骨细胞等。由于国际上对Cygb在细胞内的确切亚定位仍存在争议，其常用的定位方式是利用绿色荧光蛋白标签(GreenFluorescentPortein，GFP)。因此，本实验利用FLAG标签(

7、8个氨基酸残基)结合细胞免疫荧光实验，对照GFP标签的定位方式来验证Cygb在肝星状细胞中的确切定位。目前国际上对Cygb能有效抗纤维化的具体机制和通路不甚明了，因此本研究建立优化的免疫沉淀(Immunoprecipitation，IP)结合双向电泳一质谱的方法来寻找与Cygb相互作用的蛋白，分析这些相互作用蛋白已知的功能和分子通路，间接预测出珠蛋白在治疗肝纤维化过程中的具体作用机制。由于文献报道，Cygb可能通过抑制氧化应激反应等方式抵御和逆转肝纤维化进程。因此用一定浓度的H20。刺激肝星状细胞系(LX-2)，构

8、建细胞氧化应激模型。通过在不同时间点检测氧化应激相关指标，观察LX-2细胞氧化应激的发生、II硕士学位论文抵御和清除的大致时间分布。为了更清楚的研究LX-2细胞在氧化应激过程中Cygb与相关基因转录水平的变化，利用荧光定量PCR(Quantitativepolymerasechainreaction，QPCR)的方法分别检测在H。02刺激下，不同时间点Cyg