exendin-4hsa长效融合蛋白的构建表达与活性研究

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1、独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得安徽大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：都诗签字日期：为脚年多月却日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解安徽大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权安

2、徽大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：召芦舒签字日期：Ⅺ华年s月四日导师签名：签字日期：啊吒年r月1日Exendin一4／HsA长效融合蛋白的构建与表达中文摘要＼删糖尿病是多因素所致的内分泌紊乱性疾病，主要有l型(胰岛素依赖型)和2型(非胰岛素依赖型)糖尿病。据预测，到2025年全球糖尿病患者人数将达3亿，其中90％为2型糖尿病。2型糖尿病的传统治疗药物主要有二甲双胍、磺脲类药物等，这些药物的长期

3、使用会导致胰岛细胞功能衰竭，不能有效控制病情发展。胰高血糖素样肽一1(G1ucagon—l汰epolyp印tidel，GLP·1)是由肠道L细胞分泌的一种肽类激素，能够刺激胰岛素的分泌、增加胰岛素的生物合成，通过调节胰岛素和胰高血糖素的分泌而影响葡萄糖代谢，对糖尿病有很好的治疗效果。促胰岛素分泌肽(Exendin．4，E4)是从生长在美国西南部和墨西哥沙漠的希拉毒蜥唾液中发现的一个激素物质，由39个氨基酸组成，与GLP．1相似性高达53％，并且生物学效应也几乎完全一致。它能增加胞内c√6山口浓度，刺激葡萄糖依赖的胰岛素分泌，抑

4、制D细胞凋亡，刺激p细胞的增殖与新生，还具有降低饥饿及餐后血糖浓度和胰高血糖素浓度等生物学效应；E4的半衰期为2．3h，远长于GLP．1的1．2min，稳定性和生物活性也明显高于GLP．1，具有更好的治疗效果。但作为糖尿病的治疗药物其半衰期仍较短，且天然产物含量较少，而化学合成的方法存在成本高、步骤多、收率低、合成过程涉及有害化学物质等缺点，尚无法满足大规模的临床需求。相关的研究表明通过基因工程方法构建长效融合蛋白既能够延长Exendin-4的半衰期，又可大大降低生产成本。本实验的研究目的主要是利用合成生物学中的BglBric

5、k方法将优化后的Exendn4基因与HSA基因进行不同方式的融合表达，通过体外活性检测筛选候选长效融合蛋白。使所获的长效融合蛋白能够在高效发挥生物学功能的前提下，延长在血浆中的半衰期，最终提高治疗效果。主要研究内容及结果包括：1．以pHID2HS～IFN质粒为模板，通过PCR扩增(在扩增引物的上下游分别添加励DI、心II和ⅣDfI、B口朋HI酶切位点)获得引入相应酶切位点的HSA基因片段，连入表达载体质粒pPICz仪A上，构建出pPICZccA—HsA表达载体。中文摘要2．通过NCBI数据库中检索到编码Exend谊．4开放阅读

6、框序列，根据毕赤酵母密码子的偏爱性进行优化后，在片段的两端分别添加励oI、曰gⅢ和肋mHI、ⅣofI酶切位点，人工合成，连入表达载体质粒pPICZ0【A上，构建出pPICz仅A—E4表达载体。3．利用合成生物学中的BglBrick方法以pPICZ0【A_HSA和pPICZQA-E4两表达载体作为基础表达载体构建出十种不同形式的Exendill．4／HSA融合蛋白表达载体，将线性化后的表达载体用电转化方法转化入毕赤酵母I洲7lH基因组中，用甲醇诱导表达，所获菌液上清经过SDS．PAGE分析，都分别获得相应的目的蛋白。4．对于诱导

7、表达的目的蛋白分别经疏水层析、阴离子层析或亲和层析进行分离纯化，最终获得了纯度达90％以上的其中八种目的蛋白。5．以GLP．1蛋白作为阳性药物，用MTT方法检测对RJN—m．5F、MIN6细胞增殖的影响、用ELISA方法检测对INS．1、MIN6细胞胰岛素分泌量的影响、用ELISA方法检测对BHK．GLP．1R细胞cAMP分泌水平的影响，通过对上述方法的综合比较，建立了用ELISA方法检测目的蛋白对MIN6细胞胰岛素分泌量的体外生物活性活性测定方法，该方法效果最好、步骤简单、重复性好，适用于融合蛋白的体外生物活性检测。6．使用

8、胰岛素检测方法评价所获的八种长效融合蛋白体外生物活性。将终浓度为250灶g／mL的八种目的蛋白，作用处于对数期的MIN6细胞，2h后，用胰岛素试剂盒检测细胞培养液中胰岛素分泌量的变化，实验结果表明八种长效融合蛋白对MIN6细胞的胰岛素分泌都有一定的刺激作用，其中(E4)4一H