人类骨肉瘤血清诊断标志物的血清蛋白质组学研究

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1、第二军医大学博士学位论文人类骨肉瘤血清诊断标志物的血清蛋白质组学研究姓名：李国东申请学位级别：博士专业：外科学（骨外）指导教师：蔡郑东20090501第二军医大学博士研究生毕业论文人类骨肉癯血清诊断标志物的血清蛋白质组学研究人类骨肉瘤血清诊断标志物的血清蛋白质组学研究(中文摘要)【研究背景及目的】目前，临床外科医生和实验室的科研人员都在致力于联合采用高通量的检测技术、生物信息学方法、分子生物学实验找到并证实新的肿瘤标志物。肿瘤标志物通常是指可以标示肿瘤生物学进展和治疗效果的肿瘤特异性基因和其产物。蛋白质质谱分析技术和基因

2、芯片技术目前是分别应用于两大组学研究中最常见的技术工具。这两种技术可以作为探索肿瘤标志物的辅助技术并可以建立肿瘤的诊断模型。在基因芯片表达谱分析研究中，候补的肿瘤标志物是一个特定的基因，有唯一的碱基序列和标识。最近几年，SELDI-TOF-MS技术，即激光解析离子化一飞行时间一质谱技术被广泛用于探索发现多种肿瘤的生物标志物。SELDI—TOF—MS技术具有高通量、可以处理血清中低丰度蛋白、对实验标本的要求较低等特点。SELDI-TOF—MS技术结合了质谱分析和色谱分析技术，促进了复杂生物体标本(体液、组织块等)的蛋白分析

3、过程。然而，与基因j卷片结果得到的确定性基因不同，SELDI—TOF—MS得到的蛋白质分析结果是用质量／电荷比值(m／zratio)描述的，并不能确定具体的蛋白质。从质谱分析中得到的结果通常不能对应到一个特定的完整的蛋白，而是具有相同分子质量的一组多肽。肿瘤治疗的关键在于早期诊断。骨肉瘤是骨科临床上最常见的恶性骨肿瘤，通常发生于青春期的青少年和儿童。目前，骨肉瘤的标准治疗模式是基于Enneking骨肿瘤分期系统的新辅助化疗和手术治疗。由于缺乏早期特异性的诊断标志物，骨肉瘤患者诊断时往往已经发展到II。或III期了．尽管自

4、从上世纪80年代新辅助化疗应用后骨肉瘤的五年生存率得到了较大提高，由于早期诊断的困难，目前仍有30—40％III期前患者和80—85％III期患者经正规治疗后五年内死亡。既往组学研究表明，骨肉瘤患者血清中的淀粉样血清蛋白(amyloidrelatedserumprotein，SAA)可能是一个候选肿瘤标志蛋白．Li第二军医大学博士研究生毕业论文人类骨肉瘤血清诊断标志物的血清蛋白质组学研究等应用SELDI-TOF—MS技术比较了29例骨肉瘤患者和20例年龄、性别相配的骨软骨瘤患者的血浆蛋白组。实验发现SAA蛋白在骨肉瘤患者

5、的血浆中表达明显高于骨软骨瘤组，试验结果得到了Westernblotting实验的有力验证。国内沈靖南等采用了双向荧光差异凝胶电泳(2-DFluorescenceDifferenceGelE1ectrophoresis，2-DDIGE)和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(Matrix—AssistedLaserDesorption／IonizationTimeofFlightMassSpectrometry，MALDI—TOF一髑)研究了人类骨肉瘤患者和正常健康成人的血清蛋白质组差异，进一步的验证试验证实SAA蛋白在骨肉

6、瘤患者血清中的表达水平明显高于健康人。然而，在肿瘤生物标志物的探索方面还存在很多技术限制。比如，对于前列腺癌，几个不同研究机构的研究结果发现的肿瘤标志物都不相同。难以证实肿瘤特异性标志物是临床应用质谱分析和基因芯片数据的最大障碍。一个有望解决上诉问题的策略就是找到一个能将基因组学和蛋白质组学结果统一起来，找到两个组学共同差异的分析平台。Deng等学者最近报道了一个新的统计学计算方法-1ink—test。研究者使用这种计算法从基因芯片和SELDI质谱两个实验数据中筛查到了前列腺癌的候选特异性肿瘤标志物。为了从两个组学数据集

7、中筛查到前列腺癌的肿瘤标志物，Link-test通过引入SWISS-PROT数据库中全部人类蛋白序列的质谱分布来确定基因标志物(基因组学)和特定质谱标志物(蛋自质组学)之间联系的重要性水准。交叉验证结果显示这种所得到的肿瘤标志物具有肿瘤特异性。这种多平台分析方法的优势在于候选肿瘤标志物的发现和证实是采用基于miCrA和蛋白质产物的两种高通量的分析方法(基因芯片和蛋白质组学)得到的。很显然，试验结果更加可信，可重复性更强。本研究的目的在于通过采用link—test统计学计算方法，联合SELDI—TOF—MS和基因芯片分析结

8、果，找到骨肉瘤患者血清中稳定的特异性标志物。最后，采用经典的分子生物试验学方法(western-blotting)验证试验结果。【试验方法】第二军医大学博士研究生毕业论文人类骨肉瘤血清诊断标志物的■清蛋白质组学研究1．标本质谱标本采用血清标本，芯片标本则选用细胞株。27例确诊的骨肉瘤患者(8-26岁)血清来自3个合作