新生隐球菌感染脑微血管内皮细胞诱导单核细胞迁移的研究

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1、南方医科大学2011级硕士学位论文Study0nmonocytesmigrationacrosSCryptococcus——一一一，formansinfectedbrain’scularmdothelialcellsneolormans-infectedrainmicrovascularendothecells课题来源：国家自然科学基金项目(81171644)专业名学位申请指导教称病原生物学人张立科师曹虹教授答辩委员会主席答辩委员会成员论文评阅人2014年5月20日广州硕士学位论文新生隐槽感黼血管内皮细胞诱导

2、单核细胞迁移的研究一、研究背景和目的硕士研究生：张立科指导教师：曹虹教授摘要新生隐球菌(Cryptococcusneoformans，Cn)是一种具有荚膜的酵母型真菌，广泛存在于土壤和鸽粪中，主要感染免疫力低下和免疫缺陷人群，其嗜中枢的治病特性极易引起中枢神经系统感染，尤其以HIV相关性隐球菌脑膜炎最为严重，死亡率极高。因此，作为AIDS最严重的真菌感染并发症，新生隐球菌脑膜炎的研究已成为HIV和真菌研究的热点。新生隐球菌以呼吸道吸入为主要致病途径，通过无症状的肺部感染后穿越肺泡．毛细血管屏障进入血循环播散至

3、其他深部组织，主要是中枢神经系统。血脑屏障(blood-brainbarrier,BBB)主要有紧密连接的脑微血管内皮细胞(Brainmicrovasclarendothelialcell，BⅧC)构成，新生隐球菌只有穿透血脑屏障才能引起脑膜炎。我们之前研究了Cn与人脑微血管内皮细胞(HumanBMEC)之间的相互作用，新生隐球菌可以诱导HBMEC产生细胞骨架肌动蛋白重排和细胞膜表面的CD44在分配。多糖荚膜是新生隐球菌主要的毒性因子。AmbroseJong等研究表明，新生隐球菌的CPSl基因编码其透明质酸酶

4、(hyaluronicacidsynthase)，后者合成透明质酸(hyaluronicacid，HA)。HA可以结合HBMEC表面的主要黏附分子CD44，与新生隐球菌黏附侵袭脑微血管内皮细胞密切相关。HA几乎是所有哺乳动物细胞的胞质成分，还可能参与肿瘤侵袭和转移的生物学过程。目前已经利用染色摘要体同源重组技术，构建了新生隐球菌B4500F02株的CPSl基因缺失株TYCC645432和CPSl基因回补株CPIP，不表达HA的TYCC645832相对于B4500F02，对脑微血管内皮细胞的粘附侵袭率明显降低，

5、证明HA作为CD44的配体，是粘附侵袭HBMEC的重要毒力因子。脑微血管内皮细胞上有多种HA的受体，如CD44，RHAMM，Ivd4，其中CD44是新生隐球菌HA的最主要受体，主要分布在细胞中的膜脂筏(1ipidrafts)上，可以在细胞膜和胞质问流动，这种流动的膜结构可能是其信号转导机制的基础。新生隐球菌感染脑微血管内皮细胞后，CD44分子再分配于膜脂筏中，由胞质向细胞膜再聚集，经过一系列信号转导使细胞骨架肌动蛋白重排，使新生隐球菌进入宿主细胞。另外，黏附分子CD44表达于多种类型的细胞中，涉及多种细胞的免

6、疫过程，如细胞与基质、细胞与细胞间的黏连和细胞迁移、生存、分化等，是一个分布广泛的细胞表面受体家族。透明质酸(HA)结合区域和一个共同的跨膜结构是CD44的保守区域。研究发现，新生隐球菌CPSl野生株刺激脑微血管内皮细胞CD44过度表达，在结合位点可见大量的CD44。同时，白细胞与内皮细胞相互作用也依赖CD44／HA。单核吞噬系统是免疫反应的第一道防线，单核吞噬细胞可以吞噬杀伤新生隐球菌，但是新生隐球菌依赖多糖荚膜等多种毒力因子可以在吞噬细胞内生存繁殖，特别是HIV感染患者单核吞噬细胞功能失调时就成为隐球菌从

7、血循环向深部组织扩散的工具。目前已有多方面的证据支持存在木马机制的穿血脑屏障模式。动物实验表明，将和单核细胞共孵育的隐球菌注入小鼠后，其脑组织真菌负荷相比单纯注射隐球菌明显增多。HIV-1gp41．190可以诱导HBMEC膜脂筏和CD44重新分布和高表达，从而促进新生隐球菌对HBMEC的黏附侵袭。趋化迁移实验是一种研究新生隐球菌感染时，单核细胞与脑微血管内皮细胞相互作用和运动的很好的实验方法和手段。实验装置是一种有特定孔径的杯状的膜滤器，将脑微血管内皮细胞铺于膜上以模拟血脑屏障。这种实验手段经常被用于共培养、

8、细胞趋化、细胞迁移和细胞侵袭等多方面的研究中。II硕士学位论文本研究目的将利用人脑微血管内皮细胞(Humanbrainmicrovasclarendothelialcell，HBMEC)构建体外血脑屏障模型，通过黏附和趋化迁移实验研究新生隐球菌感染HBMEC对单核细胞的粘附和迁移通过血脑屏障的影响，HIV-Igp41．190单独作用以及与新生隐球菌协同刺激HBMEC对单核细胞迁移通过血脑屏障的影响；