脓毒症患者共刺激分子的表达及与免疫状态的关系

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第二军医大学硕士学位论文脓毒症患者共刺激分子的表达及与免疫状态的关系姓名：朱佳丽申请学位级别：硕士专业：麻醉学指导教师：李金宝20120510 脓毒症患者共刺激分子的表达及其与免疫状态的关系摘要一、单核细胞表面HLA．DR判定脓毒症患者免疫状态的可行性研究【目的】验证CDl4+单核细胞表面人类白细胞抗原．DR(HLA．DR)的表达判定脓毒症患者免疫状态的可行性。【方法】1．纳入2011年1月～2011年12月收住第二军医大学附属长海医院加强治疗病房(ICU)并符合脓毒症诊断标准的患者37例(脓毒症组)，选取10例健康成人自愿者作为正常对照(正常对照组)；脓毒症患者按28天生存与否分为存活组和死亡组。2．采集脓毒症患者外周血，采血时间为入ICU并确诊脓毒症24h内。3．采集脓毒症患者病史、诊疗情况、生命体征和临床检验(血常规、动脉血气分析、血液生化分析、病原学报告)结果等临床资料，记录患者APACHEII评分、SOFA评分、MODS评分，评价患者的病情严重程度。4．流式细胞术(FCM)检测脓毒症患者和健康成人外周血各类免疫细胞计数和单核细胞上HLA．DR的表达水平。5．分析HLA．DR表达与免疫细胞计数和病情严重程度的相关性。6．比较存活组和死亡组脓毒症患者HLA—DR的表达和病情严重程度。7．比较CDl4+单核细胞上HLA．DR表达大于30％和小于等于30％患者的病死率，验证CDl4+单核细胞上HLA．DR表达水平小于等于30％作为脓毒症免疫抑制标准的可行性。8．所得数据予以统计处理，计量资料以i±肋表示，计数资料采用Fisher确切概率法统计，计量资料采用独立样本的t检验(两组)或单因素方差分析(三组)；Speann柚法分析参数之间的相关性。应用SPSSl8．O和Gr印hPrism5统计软件分析处理。 第二军医大学硕士学位论文【结果】1．共纳入37例脓毒症患者，男性27例，女性10例，年龄62．9士15．5岁，病死率43．24％(16／37例)：APECHEII评分、SOFA评分、MODS评分分别为17士1．1分、7．8士4．3分、5．7士3．7分。2．脓毒症患者CDl4+单核细胞上HLA—DR表达水平为51．6％士25％，显著低于健康成人(90．7％士7．4％，尸O．05)。4．死亡组患者HLA．DR的表达水平显著低于存活组患者(P均0．05)。6．RoC曲线下面积显示CDl4+单核细胞表面HLA—DR的曲线下面积最大，而在共刺激分子中，CD40的曲线下面积最大，说明CDl4+单核细胞表面HLA．DR与脓毒症患者的预后最相关，其次为CD40，HLA．DR表达水平越低，或CD40表达水平越低，脓毒症患者的病死率越高。【结论】．1．不同免疫状态下脓毒症患者共刺激分子表达有显著差异，正负共刺激分子表达失衡可能是引起脓毒症免疫抑制的重要因素之一。2．CDl4+单核细胞HLA—DR和CD40表达水平对脓毒症患者预后有一定的预见性。【关键词】脓毒症，免疫抑制，单核细胞，人类白细胞抗原一DR，共刺激分子 脓毒症患者共刺激分子的表达及其与免疫状态的关系AbstractPart1FeasibilitystudyoneValuatingimmunestatusinsepticpatientsbytheexpressionofHLA—DRonmonocytes【objectiVe】Tov甜母thattheexpressiono仆哪aIlleukocyte锄tigell．DR(HLA．DR)onCDl4+monocytesmayserve舔arelia_blehallmarkofalteredimmunestatIlsins印ticpatients．【Methods】1．Atotalof37patientswithaclinicaldiagnosisofs印siswereenrolledinthisclinicaltrial．Pati册tsweresele曲ed蜀romtheinteIlsiVecareunit(ICU)ofChaIl曲aihospital舶mJ雠ua巧2011t0DeceIllber2011．10healthyadultVolullteerSwereincluded髂tllecontI．0lgroup．Basedonthe28-daysuⅣiVal，s印ticpatieIltswerccl舔sificdint0suIViVal目的upandnon—suⅣiVal毋．oup．2．P舐pheralbloodw硒collected舶ms印ticpati肌tswithin24hoursoftheonsctofs印sis．3．111ed锄。伊aphics她dclinicalchmct函sticsofs印ticpati饥tswercrecordedonstlldyeIlrollm吼t．Ⅵtalsi印s(BP／HR瓜R／T)锄dlaborato珂valueswereC0llected，觚dAPACHEIIscorc，SoFAscoreandMODSscorewerccalculatedt0evaluatethescV嘶tyofdisease．4．Countsofimmunecclls锄dHLA—DRexpressiononmonocytesiIlperipheralbloodofpatieIlts锄dhealmyVolunteerSweremeasuredbyflowc”ometry．5．AnalysistllecorrelationofHLA-DReXprcssiononmonoc”∞witllcountsofimmunecells锄dthesev耐tyofdisease．6．ComparetlleexpressionofHLA-DRonmonoc”esandtheseVerityofdise弱ebet、Ⅳe朗suⅣivalgroupalldnon-surviValgroup．7．ComparetllemonalitybetweenpatientswithtlleHLA-DRexpressiononmonocytes>30％锄dthosewiththeHLA-DRexpressiononmonoc”es=30％．ToV甜fytheprcdictiVeValueofHLA-DRbelow30％forimmunosuppressiVeins印ticpatients．-5- 第二军医大学硕士学位论文8．Statisticalanalysiswaspe墒medwimsofhareGraphPadPrism，VerSion5．Oa11dso脚areSPSS，Versionl8．O．舢lcontinuousV撕ableswereanalyzcdbystudeIlt’sttest(2groups)aIldANoVA(3groups)．CategoricalV撕ableswerecomparcdbyFisherprobabilities．A觚o-sidedP．30％，Ⅱlemortalityofs印ticpatientSwitlltlleHLA—DRexpressiononmonocyt船230％waSmuchhi曲er．1Conclusionl1．TheHLA—DRexpressiononCD14+monoc”esdecreausodins印ticpatientS．2．TheHLA·DRexpr鹤siononCD14+monocyt懿mightbeVaJua_bleindetemlinationofalterodimmunest咖sandthesev丽tyofdise邪eins印ticpatientS．3．AⅡlI。esholdof30％is胁incd嬲tllestamdardtodistinguishs印ticpatieIltS诵thiIrlmunosuppressionornot．．6． 脓毒症患者共刺激分子的表达及其与免疫状态的关系Part2Theexpressionofco-stimulatorymoleculesinsepticpatientsatdiffbrentimmunestages【objectiVelTbdetecttheexpressionsofco-stimulatoD，moleculesanddetenllinethecollrelationofth锄withtheseVerityofdiseaseins印ticpatientsduringdiff打entimmunestages，inVestigatingtheprcdictiVeValueofthesemoleculesonpro弘osisofs印ticpatieIlts．【Methodsl1．37s印ticpatieIltsaIld1OhealthyVolunteerSwereincludcd(des嘶bedinPan1)BausedontheleVelofHLA-DReXpressiononmonoc”es，alls印ticpatieIltsweredividedintoimmuIlosuppressiongroup(HLA-DRexpression=30％)aIldnon-immunosuppression罂’oup(HLA-DRexpression>30％)．2．Comparethemortali吼APACHEIIscore，SOFAsC0re锄dMODSscoreofs印ticpatientsbe帆e胁suⅣiVal锄dnon—surviValgroups．3．PositiVeco-stimulato巧molecules，f．巴，CD28／CD80(CD86)，CD40／CD40L，锄dnegatiVeco—stimulatorymoleculesPD-1锄dPD—L1wereme硒uredonv撕ousimmunecellsofperipheralbloodbynowc”ome缸y．Andcomparetlleexpressionsoftllosec0-stimulato巧moleculesins印ticpatientsb印ⅣeensurviVal锄dnon—survival伊oups．4．AnalysisthecorrelationofthosemoleculeseXprcssionwitllHLA．DRcXpressiononmonoc”esandtheseV“tyofdise嬲e．5．CompareleVelsofthosem01eculesbetweensuIViVal觚dnon—survival伊oups．6．IIlordert0comparctheprcdictiVeValueoftheC0一stimulato叫molecuresins印sis，rcceiVeroperatingcharact谢stic(ROC)cuⅣew硒usedt0calculatetheareallIldercurve(AUC)ofHLA-DRandseleCtedc0-stimulato巧molecules．7．Statistical锄alysiswasperf．0咖edwimso脚areSPSS，ve娼ionl8．O锄dso脚areGraphPadPrism，Version5．O．Me弱ur锄∞tdat勰werecxpressedby孑±JsrD锄d锄alyzedbystudeIlt’sttest(2伊oups)肌dANOVA(3伊oups)．A觚o．sidedP．18周岁；2、确诊脓毒症；3、有完整病例资料；4、获得知情同意。(二)脓毒症的诊断标准(符合2008年拯救脓毒症运动ssc的诊断标准)l、感染参数：确诊的感染或高度疑似的感染；2、满足SIRS诊断标准中任意两条(1)发热(体温>38．3℃)或低体温(体温<36℃)； 第二军医大学硕士学位论文(2)心率>90次／分；(3)气促，呼吸频率>20次／分或PaC02<35mmHg；(4)白细胞计数>12×109／L或<4×109／L，或分类杆状核>10％。(三)排除标准1、存在自身免疫系统疾病、免疫缺陷或长期服用免疫抑制剂的患者；2、既往有肿瘤患者；3、既往存在慢性感染性疾病者：4、既往存在肝肾功能障碍者。三、方法一、／J，二、(一)标本收集采血时间为患者进入ICU确诊为脓毒症后的24h内，用含EDTA．K2抗凝剂的采血管采集静脉血液5ml，6h内部分置于流式管进行表面分子标记。(二)临床资料收集临床资料收集包括病史、诊疗情况、采血时的生理指标(体温、血压、心率、呼吸参数)、使用药物、采血当日的血常规、肝肾功能、血气分析及病原菌检测报告等。记录患者急性生理与慢性健康II(APACHEII)评分、序贯脏器功能衰竭(SoFA)评分、多器官功能障碍综合征(MODS)评分以及28d生存状况。APACHEII评分等评分标准如下： 脓毒症患者共刺激分子的表达及其与免疫状态的关系表lAPACHEII评分A(APS)．生理指标分值A记分+4+3+2+l0+l+2+3+41．体温(腋F℃)=4l39．40．938．5．38．936．38．434．35．932．33．930．31．9=29．92．平均动脉雎(mmHg)=160130．159110．12970．10950．69=493．心率(次／分)=180】40．179110．13970．10955．6940．54=394．呼吸频率(次／分)=5035-4925．3412．2410．1l6．9=55．Pa02(mmHg)>7061．7055．60<55(Fi02<50％)AaD02(Fi02>50％)=500350-499200．349<2006．动脉血PH=7．77．6．7．697．5．7．597．33．7．497．25．7．327．15—7．24<7．15或血清HC03(mmol，L：=5241．51．932_40．923．31．918．21．915．17．9<157．血清Na(mmol／L)=18016m179155．159150．154130．149120-129111．119=llO8．血清K(mmo儿)=76．6．95．5．5．93．5．5．43．3．42．5-2．9<2．59．血清肌酐(mg／dL)=3．52．3．41．5．1．90．6．1．4<0．6lO．血球出积(％)=6050．59．946．49．930．45．920．29．9<2011．WBC(‘1000)=4020．39．915．19．93．14．91．2．9250180~250120~17580：25翟呼吸支持(是／否)血小板(10札)胆红素(Ilmon0平均动脉压(mmHg)多巴胺剂量(嵋／k∥min)肾上腺素剂量(蚓k∥min)去甲肾上腺素剂罱(陷，kg／min)多巴酚丁胺(是／否)GCS评分肌酐(岬ol／L)>150<20=7015<11010l～1505l～10020～3233～10l<7013～14是21～50102～204>5=0．1是lO～126～9110～17017l～299300～440是<2l>204>15>O．1>0．1<6》44024小时尿量(ml／24h)20l～500<200表3MODS评分分数评器官系统O234分呼吸(Pa02／Fi02)肾脏(血Cr岬oI几)>300=100226～300151～22576～150101～20020l～350351～500肝脏(血胆红素岬ol／L)=202l～6061～12012l～240心血管(PAR；HRxCVP／MAP)=10．O10．O～15．015．1～20．020．1～30．0血液(血小板计数109／L)>1208l～1205l～802l～50神经系统(GlaSgowC彻诅)1513～1410～127～9总分．18．=75>500>240>30．O=20=6 脓毒症患者共刺激分子的表达及其与免疫状态的关系(三)流式细胞仪检测单核细胞表面HLA．DR表达1、样本制备(1)试管标记取流式细胞仪专用的FALCON试管，并做好标记及相应的顺序编号，每份标本四管，分为l号管(空白对照管)、2号管(CDl4单标管)、3号管(CDl4／同型对照双标管)和4号管(CDl4／HLA．DR双标管)。(2)加样在各管中分别加入100“l混匀的血液。(3)免疫荧光染色在管2中加入CDl4(APC)5pl，管3中加入CDl4(APC)和同型对照抗体MouSelgGlPerCP—Cy5．5各5pl，管4中加入CDl4(APC)和HLA—DR(PE—Cy5)各5“l，低速涡流混匀试剂和血液3s，室温避光反应15～30miIl。(4)溶解红细胞在各试管中加入溶血素LysingSolution(1×)2ml，低速涡流混匀器混匀，室温避光放置10~12miIl。(5)洗涤去除细胞碎片及未结合抗体室温条件下3009离心5m访，弃上清，控干，再加入2“PBS洗涤，低速涡流混匀器混匀，3009离心5miIl，弃上清，控干。(6)固定细胞加入1％多聚甲醛O．5ml，低速涡流混匀器混匀。(7)样本保存制备完成的样本可立即进行FACS检测，或放入2～8℃冰箱保存，24h内测定。 第二军医大学硕士学位论文2、流式细胞仪检测(1)单核细胞设门软件自动获取数据，并根据白细胞的光散射(SSC／FSC)，可将其分为淋巴细胞、单核细胞和粒细胞三类细胞。以单核细胞设门，即Rl。GO(2)CDl4设门Gl显示R1单核细胞群，获取数据，根据CDl4荧光参数设门，即R2。G1(3)同型对照(Pe庀P—Cy5．5)Gl显示Rl单核细胞群，获取数据，以CDl4(APC)为横坐标，HLA．DR(PerCP—Cy5．5)为纵坐标，以此管的阴性细胞画出十字线。将细胞表型分为双阴性、双阳性、Pe屹P—Cy5．5染色阳性、APC染色阳性四个部分，并将Pe疋P．Cy5．5阳性、双阳性分别控制在5％以下。 脓毒症患者共刺激分子的表达及其与免疫状态的关系(4)检测单核细胞表面HLA-DR的表达水平设置G2=Rlandl也。即G2中显示的是单核细胞中CDl4+细胞。将同型对照的十字线拷贝至各管的散点图中，统计分析CDl4+细胞中HLA．DR的阳性率以及平均荧光强度分别为82．5％和1109。G2(四)流式细胞仪检测外周血免疫细胞数需计数的免疫细胞包括：白细胞、总淋巴细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和CDl4+单核细胞。白细胞和淋巴细胞总数为采血当天的血常规计数，其他三种细胞采用流式细胞仪计数，流程如下：1、样本制备(1)试管标记取流式细胞仪专用的F．ALCON试管，并做好标记及相应的顺序编号，每份标本四管，分为1号管(空白对照管)、2号管(CD4单标管)、3号管(CD8单标管)和4号管(CDl4单标管)。(2)加样在各管中分别加入loo“l混匀的血液。(3)免疫荧光染色≮奉山【瓦茁q-，!¨聿：k 第二军医大学硕士学位论文在管2、管3、管4中分别加入CD4(FITC)、CD8(PE)和CDl4(APC)荧光抗体各5ul，低速涡流混匀试剂和血液3s，室温避光反应15～30min。(4)(5)(6)(7)同前面的第(三)部分2、流式细胞仪检测(1)单核细胞或淋巴细胞设门软件自动获取数据，并根据白细胞的光散射(SSC／FSC)，可将其分为淋巴细胞、单核细胞和粒细胞三类细胞。以单核细胞或淋巴细胞设门，即Rl。(2)CDl4，CD4或CD8设门Gl显示R1单核细胞群，获取数据，根据CDl4、CD4或CD8荧光参数设门，分别为CDl4+单核细胞、CD4+T细胞或CD8+T细胞。设置设门细胞的属性，显示CDl4+单核细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞数(细胞数／m1)。四、统计学分析1．计量数据以i±肋表示；2．所有计量资料性正态性检验，若非正态分布变量，则采用loglO进行转换；2．脓毒症组和正常对照组间的计量资料分析采用独立样本的t检验(2组比较)或方差分析(3组比较)：3．比较HLA．DR的表达水平与APACHEII评分、SoFA评分、MoDS评分等相关性采用Spe踟锄相关分析法；4．不同HLA．DR表达水平的患者死亡率差异采用Fisher确切概率法；5．应用Grap”adPrim5进行统计分析，尸<0．05有统计学意义。仕甲耋口木一、脓毒症患者的一般资料患者一般资料如表l所示，脓毒症患者年龄为62．9士15．5岁；男性27例，女性lO例；死亡人数16例(40．5％)：原发疾病以消化道梗阻和穿孔为主(40．5％和45．9％)；腹腔感染30例，肺部感染5例，血液感染2例，其他部位感染2例：主要是G。菌群感染(54．1％)；APECHEII评分、SoF．A评分、MODS评分分别为17士1．1分、7．8士4．3分、5．7士3．7分。 脓毒症患者共刺激分子的表达及其与免疫状态的关系表1脓毒症患者一般资料(n=37)Table1Theclinicalcharact甜sticsofs印ticpatients变量脓毒症患者(n=37)二、单核细胞表面HLA．DR表达和免疫细胞计数(一)脓毒症患者和健康成人单核细胞表面HLA．DR表达FCM检测脓毒症组和正常对照组CDl4+单核细胞上HLA．DR表达百分比和平均荧光强度(MFI)。结果显示：与正常对照组(90．7％士7．4％，MFI2037．6士407．4)相比，脓毒症组患者CDl4+单核细胞上HLA．DR表达(51．6％士25％，MFI438．3士234．2)明显．23． 第二军医大学硕士学位论文下降(氏0．01)。表2—1正常对照组和脓毒症组CDl4+单核细胞HLA．DR表达Table2．1TllepercentageaIldMFIofHLA—DReXpressiononCDl4+monoc”esinsepsisandcon仃olgroup注：与正常对照组相比，”尸<0．0l∞加柏20O摹臣Q《J王酲凸《-jZko‘工．=CDl4+图1．1正常对照组和脓毒症组CDl4+单核细胞上HLA．DR表达Figure1．1TheexpreSsionofHLA—DRonCDl4+monoc”csincon仃0l孤ds印sis．24．目的ups摹备_凸U乏Q．—‘墨 脓毒症患者共刺激分子的表达及其与免疫状态的关系(二)脓毒症患者和健康成人免疫细胞计数的比较FCM检测脓毒症组和正常对照组外周血CD4+T、CD8+T和单核细胞数，记录血常规检查单上白细胞和总淋巴细胞数。结果显示：与正常对照组相比，脓毒症组患者白细胞计数明显升高(氏O．05)；而总淋巴细胞数、CD4+T细胞、CD8+T细胞和单核细胞数显著降低(尸均0．05)。表3．1脓毒症患者HLA．DR表达与免疫细胞计数的相关性(n=37)Table3—1CollrelationofHLA-DRexpressionwitlltllecountsofperipheralimmunecellsins印ticpatients(二)脓毒症患者HLA．DR表达与病情严重程度的相关性分析临床上使用APACHEII评分、SoFA评分、MoDS评分评价患者病情严重程度。FCM检测单核细胞上HLA．DR的表达水平，对脓毒症患者的HLA—DR表达与APACHEII评分、SOFA评分、MoDS评分分别作相关性分析。结果显示脓毒症患者CDl4+单核HLA—DR的表达与剐队CHEII评分、SOFA评分、MoDS评分均呈负相关，相关系数分别为一O．5802、一0．7l、一0．7044(P均0．05)；与non．IS组相比，IS组CD28、CD80、CD86的表达水平均显著下降衅0．01)。散点图下方为三组差异典型流式图。(non．IS，非免疫抑制组；IS，免疫抑制组1表2．1正性共刺激分子CD28／CD80(CD86)的表达1曲le2—1TheexpressionofCD28锄dCD80(CD86)ins印ticpatieIlts锄dhealthycontrols．40． 脓毒症患者共刺激分子的表达及其与免疫状态的关系l∞80享～60盆逭罱40口U20O零∞N已UcoⅡtrolnon．ISIS5．9．潮I鼻’'79．6’。≯I棚够38．1謦CD4+图1．1CD4+T细胞上CD28的表达(散点及流式差异图)Figure1．1TheexpressionofCD28onCD4+T1ymphoc”esins印ticpatientswcon仃01group，‘P<0．05，¨P<0．0l；垤non．ISgroup，棚氏0．01享‘凸望k笛U零∞N盆U2．7·幡境41．9簟湮、潮嘭23．2!虚1F?CD8+图1．2CD8+T细胞上CD28的表达(散点及流式差异图)Figure1．2TheexpressionofCD28onCD8+Tlynlphoc”esins印ticpatients馏con仃olgroup，“P<0．0l；坩non．ISgroup，纠氏O．01．41． 第二军医大学硕士学位论文．42．零o∞盘U1008060柏200controlnon—ISIS‘j囊嫌683◆22．67F峨_酽CDl4+图1．3CDl4+单核细胞上CD80的表达(散点及流式差异图)Figu-re1—3TlleexpressionofCD80onCD14+monoc”esins印ticpatients谘con仃olgroup，¨尺0．Ol；Ⅷnon．ISgroup，槲尸O．05)，与SoFA评分、MODS评分呈弱相关(尸<0．05)。表4．3脓毒症患者PD．1／PD．L1的表达与病情严重程度的相关性T’able4·3CorrelationofexpressionsofPD-1锄dPD-LlwiththeseVerityofdiseaseins印ticpatients注：尸均<0．05三、HLA．DR和共刺激分子预测脓毒症患者预后价值的比较(一)存活组和死亡组患者共刺激分子的表达脓毒症患者按28天生存与否分为存活组和死亡组，存活组2l例，死亡组16例，t检验比较两组共刺激分子的表达水平，结果显示，与存活组相比，死亡组CD4+T细胞表面CD28、CDl4+单核细胞表面CD80显著降低(氏0．05)，而两组CD8+T细胞表面CD28和单核细胞表面CD86的表达无差异(尸>0．05)；与存活组相比，死亡组正性共刺激分子CD40和CD4+T细胞表面CD40L均显著降低(P均<0．05)，而两组CD8+T细胞表面CD40L的表达无显著差异(户>o．05)；而与存活组相比，死亡组负性共刺激分子PD．1／PD．Ll的表达均显著升高(P