微透析液相色谱联用的构建及在经皮药动学研究的应用

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1、第二军医大学博士学位论文微透析液相色谱联用的构建及在经皮药动学研究的应用姓名：王丹申请学位级别：博士专业：药物分析学指导教师：石力夫20090501微透析液相色谱联用的构建及在经皮药动学研究的应用摘要研究目的：微透析(Microdialysis，MD)技术是近年来新兴的一种生物活体取样技术，它是利用物质沿浓度梯度扩散和半透膜对小分子化合物具有通透性的原理设计的，具有原位取样、实时、在线、无需样品预处理、动态检测等特点。其与色谱分析仪器联合应用为体内药物分析开辟了高效、精确、简便的新途径．目前国外微透析技术已经与多种色谱分析仪器进行了在线联用，形成了标准化商品，但其设备价格昂贵，国内均依

2、靠进口，欲在我国推广这一新的分析技术，设备的国产化势在必行。中药经皮给药系统在我国历史悠久，目前评价中药及其有效成分经皮给药的研究系统最常用的方法是应用Franz扩散池测定药物的透皮速率，以此来预测药物的生物等效性。但Fmnz扩散池存在一些不足，如不能满足溶液流体动力学、离体皮肤的物理化学结构和生理条件发生显著差异等，都影响实验数据的准确性与科学性。因此将自行研制与构建微透析与液相色谱在线联用技术应用到中药经皮给药的体内药动学与代谢研究中，克服了以往研究方法的不足，为开展这一新技术创造了条件，提供了可靠和全新的手段。同时也为中药现代化研究与中药的质量控制提供了的先进、可行的新技术。研究

3、方法与结果：l葛根素高效液相色谱条件的建立与离体大鼠皮肤体外渗透性实验研究本研究建立了测定葛根素的高效液相色谱方法。色谱柱：HypcrsilC18柱(5№4．6mmX150mm)；紫外检测波长：251衄；流动相：甲醇：水(含0．1％醋酸)(30：70)；流速：Imin-mL一；柱温：室温：254-0．10C。药物浓度与峰面积之间成良好线性关系。方法精密度好、准确度高，符合分析要求。采用改良Franz竖直扩散池，以卡波姆、氮酮为辅料制备葛根素凝胶剂，离体大鼠皮肤为透皮屏障，用HPLC法测定葛根素的累积渗透量。实验结果表明，葛根素凝胶剂体外透皮释药时间累积透过量拟合方程：Q=11．12t-

4、45．18，=o．9635，32h累积渗透量为335．184-51．45pg／cm2。葛根素以一级动力学透过皮肤，所研制的葛根素经皮给药系统体外渗透性能良好，质量控制方法简便、快捷、准确。2微透析与高效液相色谱技术(离线)联用对葛根素凝胶剂型经皮给药系统的药代动力学研究本研究首次以中药单体葛根素模型药物，采用微透析取样与高效液相色谱分析(离线)联用技术(MD．I-IPLCoff-line)，考察了其微透析探针体内外回收率，继而进行了葛根素凝胶剂经皮给药系统的皮肤药代动力学和代谢过程的研究。所得数据经kinetica软件处理，得到葛根素经皮给药后皮下葛根素浓度．时间曲线图。其中药时曲第二

5、军医大学博士学位论文线下面积为(AUC)2335．14ug·mill·mL一，半衰期为(Tl曲230．515rain，消除速率常数为(Lz)0．003，最大血药浓度为(Cm戤)4．62277mg／mL与其所对应的时间为(Tm疆)460mill。3微透析与高效液相色谱在线联用技术平台的构建本研究在国内率先自行研制与构建微透析与高效液相色谱在线联用平台(MD．HPLCon．1ine)，采用lO孔自动进样阀将微透析设备与高效液相色谱系统，通过聚丙烯、聚醚醚酮、弹性熔融石英毛细管三种材质的管路，经美国CYBERBOND(Apollo)瞬间生物兼容性粘合剂粘合而联为一体。实现软件联动，最终达到1

6、0孔自动进样阀进样的同时，高效液相色谱系统检测器对样品同时进行监测，仪器性能数据应用SPSS软件，配对T检验对3种浓度(O．1ug／mL，10ug／mL，100ug／mL)的葛根素出峰时间理论值与实测值，进行统计学分析，Po．1=o．239，P10=O．617，PI旷0．809，P值均大于O．05，无统计学意义，既葛根素的理论值和实测值没有显著性差异。因此得出结论，本实验建立的VCOM和CLASS-VP软件分别控制10孔自动进样阀和HPLC系统，可以做到进样和检测同步完成，仪器精密、准确，完全可以达到实验的要求，实现了微透析取样与高效液相色谱检测在线联动。仪器设备价格低廉、简便实用，经

7、济可靠。这将成为国内第一台自行构建并投入实用的在线联用装置，为推动这一新技术在我国的广泛应用奠定了基础。4微透析与高效液相色谱离线与自制在线联用平台性能的考察与比较本研究以葛根素为模型药物，测定MD．HPLCoff-line与自制的MD．HPLCon．1ine的仪器精密度、重现性、稳定性等相关参数，考察MD-HPLCon．1ine仪器性能，发现与解决存在的问题，进一步改进与完善该系统，数据经SPSS13．0统计软件分析，具体结果如下所示：1)回