超声辐照下携载arsirna的纳米级微泡抑制aipc生长的实验研究

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1、第三军医大学硕士学位论文超声辐照下携载ARsiRNA的纳米级微泡抑制AIPC生长的实验研究姓名：张淼申请学位级别：硕士专业：影像医学与核医学指导教师：郭燕丽201205第三军医大学硕士学位论文超声辐照下携载ARSiRNA的纳米级微泡抑制AlPC生长的实验研究木摘要背景前列腺癌是男性高发的恶性肿瘤之一，常规去激素治疗后多数会在12—18个月内发展成为雄激素非依赖性前列腺癌(AIPC)，目前临床上对于AIPC缺乏有效的治疗方法。雄激素受体(AR)在AIPC的发生发展中起到关键作用，利用RNA干扰技术，阻断雄激素受体的表达可以起到治疗AIPC的作用

2、并已经在体外实验中取得良好的效果。但同其他肿瘤的基因治疗一样，前列腺癌临床或体内基因治疗效果不尽理想，存在基因转染率低，治疗基因难以聚集到靶组织内等问题，其主要原因是缺乏一种安全、可控、靶向的基因递送载体。超声微泡的出现为解决基因治疗这一瓶颈问题带来了希望，超声微泡介导的靶向基因治疗方法既可增强基因在肿瘤细胞内的转染和表达情况，又能提高基因治疗的靶向性，减少全身不良反应，与其它方法相比，具有安全、有效、靶向性强等优点，是一种很有前景的临床肿瘤治疗技术。随着纳米医学和超声造影剂的飞速发展，纳米级超声微泡成为超声造影剂的发展趋势。与常规微米级微泡

3、相比，纳米级微泡具有较强的穿透力，稳定性高，包载率及携载基因转染效率高等特点，在肿瘤的基因治疗和靶向显影方面逐步体现出其巨大的优势。研究目的基于以上研究进展，本研究拟在筛选出最有效的ARsiRNA序列基础之上，利用纳米级超声微泡作为基因递送载体，制备携载ARsiRNA的纳米级超声微泡，检测其体内外特性，并在超声辐照下转染前列腺癌细胞。在细胞分子生物学水平评价携载ARsiRNA纳米级微泡抑制AR基因的表达及前列腺癌细胞生长的效果。为超声辐照下纳米级微泡+本研究为国家自然科学基金(面上项目)：超声辐照下携载ARsiRNA的纳米级微泡抑制AIPC生

4、长的实验研究(30970830)6第三军医大学硕士学位论文作为体内基因载体治疗AIPC肿瘤提供实验依据和研究基础。方法1．设计并合成三种靶向于雄激素受体的siRNA，利用当今广泛应用的脂质体转染法，以不同浓度转染AIPC细胞C4—2，确定最佳转染浓度。RT-PCR和Westernblot分别检测转染后ARmRNA表达水平和AR蛋白表达水平。CCK一8分析绘制细胞生长曲线，观察C4—2细胞生长活性并筛选出抑制效果最佳的siRNA靶序列。2．通过机械振荡及低速离心法制备空白纳米级微泡，利用多聚赖氨酸法制备携载ARsiRNA的纳米级超声微泡，检测两

5、者微泡粒径，表面电位及微泡与siRNA结合情况。在裸鼠前列腺癌移植瘤进行造影显像研究，并与常规微米级微泡(SonoVue)对比造影效果。3．超声辐照下携载ARsiRNA的纳米级超声微泡转染LNCap、C4—2和PC一3三种前列腺癌细胞，流式细胞仪测定转染率，筛选最佳超声辐照条件和微泡浓度范围。RT-PCR和Westonblot检测转染后ARmRNA和AR蛋白表达水平，CCK一8分析绘制细胞生长曲线，评价ARsiRNA沉默靶基因对前列腺癌细胞生长的抑制效果。结果1．以100nM最佳转染浓度转染C4．2细胞后，AR的mRNA和蛋白表达水平显著下降

6、，细胞增殖活性显著降低，并根据抑制效果筛选出最有效靶序列。2．荧光显微镜下观察纳米级微泡与ARsiRNA紧密结合，并可以通过提高ARsiRNA浓度来增加载基因量。粒径检测仪测量平均粒径(608．2±13-3)nm，Zeta电位(一29．9±6．5)mV。与“SonoVue”比较，纳米级微泡体内显影时间较前者显著延长(P<0．05)，肿瘤中心乏血管区域显影效果较好。3．超声辐照下携载ARsiRNA的纳米级微泡转染前列腺癌细胞，获得最高细胞转染率的体外超声辐照条件为MI=I．2，辐照时长=2min，微泡量／细胞量=100：1(载基因量18．94x

7、10习nmol／个)。转染后24小时光镜观察C4—2和LNCap细胞的裸ARsiRNA+超声辐照组、裸ARsiRNA+空白纳米级微泡+超声辐照组和携载ARsiRNA的纳米级微泡+超声辐照组均出现细胞形态变化，以48小时变化明显，主要表现为细胞轮廓模糊，形态萎缩，生长缓慢，而PC一3细胞形态变化不明显。RT-PCR和Westernblot结果显示：上述三组C4—2和LNCap细胞的ARmRNA和AR蛋白表达分别受到不同程度的抑制，其中携载ARsiNA的纳米级微泡+超声辐照组的抑制作用最为明显。CCK8分析结果显示：C4—2和LNCap细胞的上述

8、三组siRNA转染C4—2细胞后均可以达到较明显的生长抑制效果，其中C4—2细胞的携ARsiRNA纳米级微泡+超声辐照组的生长抑制7第三军医大学硕士学位论文率最高，