肝癌患者cd4+cd25+cd127low-cd49d-调节性t细胞与肝癌复发转移关系的研究

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1、复旦大学博士学位论文肝癌患者CD4+CD25+CD127low/--CD49d--调节性T细胞与肝癌复发转移关系的研究姓名：吴寒申请学位级别：博士专业：外科学指导教师：邱双健2012-03中文摘要肝癌患者CD4+CD25+CDl27low／-CD49d‘调节性T细胞与肝癌复发转移关系的研究肝细胞肝癌(hepatocellularcarcinoma，HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一，在恶性肿瘤相关死亡率中位居第三位。我国是肝癌高发地区，约占全球肝癌病例一半以上。肝癌严重影响我国人民的健康事业，并带来了巨大的社会负担。由于肝癌早期诊断较难，患者就诊时往往己属晚

2、期。虽然近来手术切除、肝移植、射频消融、肝动脉栓塞化疗和分子靶向治疗等手段对肝癌的治疗取得了很大的进步，但总体上术后高复发率和高死亡率近来未有明显改善。免疫治疗作为肿瘤最有希望的治疗手段越来越受到重视。同时肝脏作为免疫特惠器官又是免疫治疗理想的靶器官。既往对肝癌的研究集中在肝癌细胞本身的生物学行为上，忽略了肝癌演进过程中肝癌细胞与肿瘤微环境(tumormicroenvironment)中各种免疫细胞之间的相互作用，而后者被认为在肿瘤的发展、侵袭中发挥重要的作用。具有免疫抑制性作用的调节性T细胞(regulatoryTcell，Treg)在肿瘤细胞逃避局部微环

3、境的免疫监视从而发生免疫逃逸的过程中，扮演着重要的角色。本研究从肿瘤微环境中调节性T细胞的特异性表面标志入手，证实了在免疫微环境中CD4+CD25+CDl27沁w／-CD49d。调节性T细胞的浸润和表达，表现为更强的免疫抑制表型，并与肝癌的临床病理特征相关。进而我们通过全基因芯片筛选出较重要的调控肿瘤浸润调节性T细胞的免疫抑制功能相关的功能基因，分析肿瘤浸润调节性T细胞与肿瘤细胞相互作用的免疫信号通路。基于凝集素芯片检测HCC患者外周血调节性T细胞膜特征性的聚糖改变。最后通过对调节性T细胞与galectin．1在HCC中表达的相关性分析，为HCC预后的预测和

4、免疫治疗提供新的选择。中文摘要第一部分HCC患者CD4+CD25+CDl27。0w厶CD49d。调节性T细胞的表达和表型研究本部分研究旨在探索CD4+CD25+CD127low／-CD49d。调节性T细胞在HCC患者体内不同部位(外周血、癌旁肝脏和癌灶)的分布和表达。我们通过梯度离心结合酶消化法，建立了稳定的获取外周血、组织内浸润淋巴细胞分离方法。借助于流式细胞仪，首次采用四色荧光分选淋巴细胞，配对比较分析了三处不同来源的CD4+CD25+CDl2710舭CD49d。调节性T细胞的分布表达和表型。发现在HCC患者外周血、癌旁肝组织和癌灶中，CD4+CD25+

5、CDl27lo舭CD49d。调节性T细胞的分布和免疫表型截然不同。首先，HCC患者肿瘤微环境中存在高表达FoxP3的CD4+CD25+CDl2fow／-CD49d。调节性T细胞。其次，HCC患者外周血调节性T细胞占整个CD4+T细胞比例显著高于健康对照者。HCC患者肿瘤浸润调节性T细胞占整个CD4+T细胞比例显著高于配对的癌旁肝组织和外周血。最后，HCC患者癌灶浸润调节性T细胞表达较高的免疫抑制表型，如FoxP3、CTLA．4和GITR。混合淋巴细胞实验显示CD4+CD25+CDl271删‘CD49d。调节性T细胞对活化分子CDl54的抑制率较对照明显增强，

6、表明具有较强的免疫抑制能力。结合体外扩增实验结果，这群淋巴细胞分泌高水平的免疫抑制因子IL一10和TGF—pl，扩增后的细胞仍保持较高的抑制表型。我们分选出的肿瘤浸润的这群具有抑制能力的淋巴细胞较癌旁肝组织和外周血来源的显示出更强的免疫抑制能力。我们首次采用四色荧光分选出的CD4+CD25+CDl27b¨CD49d。T淋巴细胞高表达调节性T细胞的特异性标志FoxP3，较其他相关研究文献可获得更高纯度的调节性T细胞，并且这群高表达FoxP3的T淋巴细胞保持活性状态，可用于下游的功能实验。CD4+CD25+CDl27low／-CD49d。T细胞高表达于肝癌肿瘤微

7、环境中，表现出更强的免疫抑制表型，体现了肿瘤免疫微环境中调节性T细胞的免疫抑制功能，参与HCC的肿瘤生物学进程。中文摘要第二部分基于全基因芯片的CD4+CD25+CDl2710w／-CD49d。调节性T细胞基因表达谱分析结合前部分研究结果和其他相关文献报道，我们可以认为癌灶浸润性调节性T细胞之所以表达增强的抑制表型，必然是受到肿瘤微环境中肿瘤细胞和其他免疫细胞的影响，导致其与免疫抑制功能相关的基因表达上调和信号通路激活。但具体参与的调控基因和信号通路尚未有系统的报道。在本部分研究中，我们利用Agilent全基因芯片对9例HCC患者配对的癌灶和癌旁肝组织中的调

8、节性T细胞进行全基因表达谱的对比分析，以期找出与免疫