慢病毒vegf165载体的构建及其在骨骼间充质干细胞中的表达

《慢病毒vegf165载体的构建及其在骨骼间充质干细胞中的表达》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、慢病毒VEGF165载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达计：学位论文：32页表格：2个插图：14幅陈鹏指导教师：李正维教授申请学位级别：硕士学位专业名称：外科学论文提交日期：2012年4月论文答辩日期：2012年5月学位授予单位：大连医科大学学位授予日期：2012年6月评阅人：答辩委员会主席：IIillliIIiillliiiiliiiliBlilliJiI独创性声明Y2283105本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大连医科大学或其他教育机构的学

2、位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名：医2圈垫签字日期：。业年三月三日目录一、摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1(一)中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1(二)英文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3二、正文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5(一)前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5(二)材料与方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯000⋯6(三)结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯10(四)讨论⋯⋯⋯⋯

3、⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯13(五)结论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯17(六)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯18三、综述⋯⋯OOOOOO⋯OOOOOOOOO⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯OOOOOOOOO⋯20(一)综述⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯20(二)参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯27四、致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯32慢病毒VEGF，晒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达硕士生姓名：指导教师：指导小组：专业名称：陈鹏李正维教授南丰副教授外科学摘要目的：提取人血管内皮生长因子1

4、65(VEGFl65)基因序列，构建VEGFl65慢病毒载体，转染大鼠骨髓间充质干细胞，利用WesternBlot检测其在骨髓间充质干细胞中的表达情况，寻求基因手段预防硬膜外瘢痕的方法。方法：(1)调取VEGFl65基因序列：从基因库找到VEGFl65的基因序列，设计引物attBl．k．VEGFl65一F，VEGFl65一attB2．R。(2)目的载体的构建：利用聚合酶链反应(PCR)方法将设计好的引物，模板DNA，底物等等进行反应，得到VEGFl65DNA，再利用Gateway技术将VEGFl65基因序列克隆至入门载体，进而克隆至目的载体，从而得到含有VEGFl65序列的表达载体。(3)慢病

5、毒的包装：取细胞状态良好，处于对数生长期的293FT细胞，细胞计数后，培养过夜。第二天转染前去除旧的培养液，加入5mL新鲜的含10％血清DMEM培养液等待转染。制备DNA．Lipofectamine2000复合物，复合物里含有pLV／helper-SL3，pLV／helper．SL4，pLV／helper．SL5，目的载体，培养基等等。将DNA—Lipofectamine2000复合物一滴一滴地添加到293FT细胞中，轻轻地前后摇晃培养皿以混匀复合物。转染后48小时收集培养上清进行浓缩；加入10ml新鲜的培养液继续培养，转染后72小时再次收集浓缩；分装好的病毒放置．80℃保存。测定滴度。(4)

6、骨髓干细胞的提取和培养：取SPF级4．5周SD雄性大鼠一只，取大鼠股骨和胫骨的骨髓，早期培养原代接种后前三次换液，每24小时换一次。由于细胞前期增殖极其缓慢，所以不需要按照常规的操作进行，大概5．7天进行换液。前期的维持培养过程大概需要40．60天，期间的换液以5．7天左右换一次。待骨髓间充质干细胞纯化后，传代一次，即可进行转染。(5)WesternBlot检测：待检测的样品分别为：大鼠骨髓间充质干细胞，转染了eGFP的大鼠间充质干细胞，转染了VEGFl65的问充质干细胞。提取蛋白后，用核酸蛋白测定仪测定样品蛋白总浓度和SDS．聚丙烯酰胺凝胶电泳，再进行蛋白质的电转移以及膜的封闭。最后进行抗原

7、抗体反应和显色，置于FiuorchemHD2凝胶成像分析系统中观察，拍照。结果：利用分子生物学技术成功构建慢病毒VEGFl65载体，VEGFl65组测定的病毒滴度为4．7x107，eGFP组为6x107。转染骨髓干细胞48小时后荧光显微镜下观察VEGFl65组的转染率为40．50％，eGFP组的转染率可达90％以上。转染VEGFl65的骨髓干细胞与未传染VEGFl65基因的骨髓干细胞比较，转染后的