microrna-133a调控血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化的功能研究

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1、分类号UDC博士学位论文密级MicroRNA．133a调控血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化的功能研究AFunctionalStudyonMicroRNA-—133aRegulatingOsteoblasticDifferentiationofVascularSmoothMuscleCells作者姓名：李师君学科专业：儿科学学院(系、所)：湘雅二医院指导教师：毛定安教授答辩委员会主席℃枣中南大学二。一二年五月原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成

2、果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。作者签名：叁堕垂学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。作者签名：查!空杰导师签名放仨日期：三坐年』月旦日＼J博士学位论文中文摘要第一部分MiR

3、NA．133a影响血管平滑H／l-幺m胞向成骨样细胞样分化的研究．目的：研究miRNA．133a(miR-133a)在小鼠血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化中的作用。方法：用Northem免疫印迹法检测miR-133a在小鼠心脏、骨骼肌、血管平滑肌细胞、胸主动脉中的表达情况。用B．甘油磷酸钠(p．sodiumglycerophosphate，。13-GP)诱导血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化，Northem免疫印迹法检测miR-133a在这一过程中的表达水平的改变。观察成骨样细胞分化指标变化：碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)活性用分光光度计检测对硝基苯酚释

4、放获得，骨钙素(Osteocalcin，OC)用放射免疫测定法测定，而细胞经茜素红染色后，用氯化十六烷基嘧啶提取染色茜素红量化矿化结节染色。Westem免疫印迹法和实时定量PCR分别检测Runx2蛋白和mRNA表达量的变化。根据miR-133a．1前体序列设计引物，退火后连接至pSilencer4．1一CMVpuro载体，构建miR-133a—l的表达载体pre—miR-133a—l。将pre—miR-133a一1转染至血管平滑肌细胞，造成miR-133a过表达细胞模型，随后予10mMl3．GP诱导分化，同样方法检测ALP活性、OC分泌以及细胞中矿化结节量的变化，Runx2蛋白

5、用Western免疫印迹法检测，Runx2mRNA表达用Northem免疫印迹法和实时定量PCR检测。结果：(1)miR-133a在心脏及骨骼肌组织中有较高水平的表达，博士学位论文中文摘要而在VSMCs和胸主动脉中少量表达。(2)与对照组相比，p．甘油磷酸钠诱导的血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化过程中，ALP活性及OC分泌水平均明显增加，Runx2蛋白表达水平显著升高，且矿化结节形成也明显增多。(3)与转染了空质粒的VSMCs相比，转染了pre．miR-133a．1的VSMCs中的miR-133a表达水平显著增加，ALP的活性和骨泌素的分泌量及矿化结节的生成随着miR-133a的

6、过表达而明显下降。miR-133a的过表达抑制了Runx2蛋白的表达，而Runx2mRNA的表达水平却未受影响。结论：用pSilencer4．1．CMVpuro质粒构建成功miR-133a。1表达载体，转染该载体可以使miR-133a在血管平滑肌细胞内稳定地高表达。过表达miR-133a抑制血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化。关键词：血管平}骨月『1细胞，成骨样细胞，miR-133a，转染II博士学位论文中文摘要第二部分MiR．133a调控血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化的机制研究目的：预测并验证miR-133a作用的靶基因，为防治动脉钙化提供理论依据。方法：用多个靶基因预测软件分析

7、得到miR-133a作用的靶基因。PCR扩增包含靶位点在内的靶基因3'-UTR，PCR扩增靶基因3'-UTR全长cDNA，连接到pcDNA3．1(+)载体构建野生型靶基因3'-UTR表达载体，以此为模板，用QuickChangesite．directedmutagenesis试剂盒靶基因3'UTR中引入三个碱基突变，构建突变型靶基因3'-UTR表达载体，这两个载体分别与pre-miR-133a．1或miR-control共同转染，加p．GP诱导分化，观察靶基因蛋白表达，靶基因蛋白表达用Wes