应用shotgun技术对旋毛虫侵入相关蛋白的初步筛选

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1、郑州大学硕士学位论文应用shotgun技术对旋毛虫侵入相关蛋白的初步筛选姓名：王蕾申请学位级别：硕士专业：病原生物学指导教师：王中全201204摘要应用shotgun技术对旋毛虫侵入相关蛋白的初步筛选硕士研究生王蕾导师王中全郑州大学基础医学院人体寄生虫学教研室(郑州450052)河南省分子医学重点学科开放实验室(郑州450052)摘要旋毛形线虫[Trichinellaspiralis(Ow∞，1835)Railliet，1895]，简称旋毛虫，是一种成虫和幼虫分别寄生在同一宿主的小肠和骨骼肌细胞内的线虫。旋毛虫引起的旋毛虫病(triehinellosis)是一种危害非常严重的食源性人兽共

2、患寄生虫病。当人或动物生食或半生食含旋毛虫的肉类后，幼虫在胃液的作用下被消化脱囊释放出来，迅速进入小肠中的多细胞内龛中。在感染性第一期幼虫钻入肠道柱状上皮细胞内龛后，称之为旋毛虫肠道感染性第一期幼虫(L1)；经29"-'36h完成4次蜕皮(L1一IA)后发育为成虫，雌雄交配，96h后产出新生幼虫，新生幼虫经血循环移行到肌肉组织，幼虫在肌肉中可以生存数年而保持感染性。因此，脱囊幼虫(肠道感染性第1期幼虫)侵入肠粘膜内继续发育或是被宿主从肠道排出，是旋毛虫能否导致宿主感染与致病的关键步骤。尽管旋毛虫侵入肠上皮细胞的体外模型已建立，但是感染性幼虫对肠上皮细胞的识别，侵入和移行的机制均不完全清楚

3、。本研究模拟旋毛虫感染宿主的环境，将感染性幼虫与小肠上皮细胞在体外共培养，对培养前后的虫体蛋白和细胞蛋白进行SDS．PAGE分离，联合Westernblot挑选出有差异的条带，采用shotgun液相色谱串联质谱系统进行鉴定，将质谱分析得到的数据应用SEQUEST软件及数据库搜索完成蛋白质的鉴定，检测旋毛虫感染性幼虫在侵入小肠上皮细胞Ij{『后虫体蛋白和细胞蛋白的变化，并对鉴定出的蛋白质从分子功能、生物学途径、亚细胞定位三个方面进行GOA分类。幼虫与细胞接触后早期表达的蛋白可能是其侵入的相关蛋白，幼虫早期表达的蛋白抗原对本病的早期诊断也可能具有重要价值。这些研究将为更深入了解旋毛虫侵入肠上

4、皮细胞机制提供有力的数据支持和参考。摘要材料与方法1．旋毛虫虫种、实验动物及细胞系本实验所用的旋毛虫为河南省南阳猪源旋毛虫(Trichinellaspiralis)，由本室昆明小鼠传代保种。20只雄性6周龄昆明小鼠(清洁级)，体重209．259，均购自郑州大学医学院实验动物中心。人回盲肠癌细胞HCT-8【HRT-I81购于中国科学院细胞库。2．旋毛虫肌幼虫的收集与激活将旋毛虫肌幼虫按照300条／只经口感染50只昆明小鼠，42d后脱颈椎处死。膈肌压片镜检证实感染成功后，剥皮、除内脏和脂肪，用搅拌器搅碎至肌肉完全搅碎。采用人工消化法消化4h，按贝氏法收集肌幼虫。将收集的肌幼虫用含5％人胆汁的

5、PBS在37℃5％C02条件下孵育2~3h，用PBS洗涤3次后，加入含抗生素的PBS中37℃孵育1h备用。3．细胞培养将HCT-8细胞接种在RPMI．1640完全培养基中，在37℃5％C02培养箱培养，2．3d即可形成致密的单细胞层，此时用于接种肌幼虫。在接种前ld按照常规方法给细胞换液，以及时去除死细胞，保证细胞状态良好。4．旋毛虫虫体蛋白和HCT-8细胞蛋白的SDS．PAGE分析及Westernblot鉴定将激活的肌幼虫与RPMI．1640培养基按5000条／ml的比例混合后加入长满HCT-8细胞的75ml培养瓶中，37℃5％C02条件下培养18h后，去除培养基与幼虫，收集肌幼虫，加

6、入O．25％胰蛋白酶．0．02％EDTA消化后收集细胞，按比例分别加入RIPA裂解液提取虫体蛋白和细胞蛋白。BCA法测得虫体蛋白和细胞蛋白后，利用SDS．PAGE及蛋白质印迹(Westernblot)进行分析。5．LC．MS／MS分析根据Westernblot的结果，比对胶上相匹配的差异条带。用手术刀片将胶上差异部分切割下来，胰酶酶解、抽提肽段。酶解后得到的肽段提取物使用LC．MS／MS系统进行分析，质谱设备为Finnigan线性离子阱串联质谱仪LTQ，mierospray模式。质谱仪配置C．18反相色谱柱，流动相A相为0．1％溶于超纯水的甲酸，B相为0．1％溶于乙睛水溶液中的甲酸。肽段

7、混合物的洗脱梯度：2*／0"-80％，洗脱时间60min，重复三次。串联质谱分析包括一个全扫描(fullMSscan)和十个串联扫描(MS／MSscan)。6．质谱数据分析和处理数据搜索引擎为Bioworksversion3．2software(SEQUSET,ThennoElectron)软件进行数据库搜索。肽段数据经SEQUEST过滤、匹配，只有分值较高的肽段被保留。过滤参数为：当Charge+l，Xeorr>1．9：当Char