缢蛏碱性磷酸酶基因的克隆及重金属铜和锌对其表达的影响

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1、学校代码：10264研究生学号：M090101008上海海洋大学硕士学位论文缢蛏碱性磷酸酶基因的克隆及重金属铜和锌题目：对其表达的影响CloneandExpressionAnalysisof英文题目：AlkalinePhosphataseGenefromS.ConstrictaunderthestressofCuandZn专业：水产养殖研究方向：水产动物种质资源与苗种工程姓名：钟玉民指导教师：李家乐教授二O一二年五月上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引

2、用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海水产大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月

3、日日期：年月上海海洋大学硕士学位论文缢蛏碱性磷酸酶基因的克隆及重金属铜和锌对其表达的影响摘要缢蛏是我国四大海水养殖贝类之一，在浙江和福建已有数百年的养殖历史。随着沿海城市经济的发展，海洋污染日益加剧，已经严重威胁到了缢蛏的生存和生长，因此必须对目前的缢蛏种质资源进行合理的开发和利用。本研究克隆了缢蛏碱性磷酸酶基因，并研究了其在重金属铜、锌胁迫作用下的表达情况。具体研究内容如下：1.缢蛏碱性磷酸酶基因的分子特性及其组织表达分析以缢蛏为材料，根据实验室构建的缢蛏肝脏cDNA文库中已标注的EST序列，利用RACE技术克隆得到了缢蛏ALP基因的cDNA全序列。该序列全长1837bp，5′

4、端非翻译区为130bp，3′端非翻译区为117bp。开放阅读框（ORF）长度为1590bp，可编码529个氨基酸，含有1个由5个氨基酸组成的信号肽。推测得到的缢蛏缢蛏碱性磷酸酶前体肽具有29个磷酸化位点，与人(Homosapiens）的碱性磷酸酶3D结构有高度的相似性。同源分析表明，该基因编码的蛋白与合浦珠母贝(Pinctadafucat)ALP氨基酸序列的相似性最高为48%。系统进化分析表明，缢蛏与合浦珠母贝聚集在一起，但与脊椎动物中的鱼类、两栖类、哺乳动物距离较远。利用实时荧光定量PCR检测成体缢蛏的水管、斧足、腮、外套膜、肝脏及性腺6个不同组织中ALP基因的表达情况，结果显

5、示缢蛏ALP基因在肝脏的表达量最高，其次为外套膜，在水管中的表达量最低。说明，成体缢蛏的碱性磷酸酶具有组织特异性。2+2+2.Cu、Zn胁迫对缢蛏碱性磷酸酶基因表达的影响2+2+运用荧光定量PCR技术分析Cu、Zn在不同剂量以及不同处理时间下对缢2+2+蛏不同组织ALP基因表达的影响。实验结果显示，Cu和Zn对缢蛏不同组织ALP2+基因的表达影响不尽相同：在Cu的胁迫下，缢蛏水管、腮、斧足、外套膜ALP基因表达呈现整体下降的趋势，肝脏中ALP基因的表达呈现先升高、后降低的趋2+势，性腺中ALP基因的表达量无明显变化；在Zn的胁迫下，水管、腮、外套膜ALP基因表达呈现先升高、后降低

6、的趋势，斧足和肝脏中ALP基因的表达呈现整I上海海洋大学硕士学位论文体持续升高的趋势，性腺中ALP基因的表达量无明显变化。实验结果还显示，不2+2+同浓度Cu、Zn以及不同处理时间与缢蛏ALP基因表达的存在一定的相关性。2+2+3.Cu和Zn对缢蛏的急性毒性研究用静态急性毒性试验方法，研究了12h、24h、36h、48h、72h和96h内重金2+2+2+属Cu、Zn对缢蛏的毒性影响。结果表明：Cu对缢蛏的2h、12h、24h、36h、-1-1-1-148h、72h和96h的LC50为1.022mg·L、0.623mg·L、0.277mg·L、0.194mg·L、-1-1-12+0

7、.073mg·L、0.064mg·L和0.044mg·L；Zn对缢蛏的2h、12h、24h、36h、48h、-1-1-1-172h和96h的LC50为34.601mg·L、26.145mg·L、23.563mg·L、9,908mg·L、-1-1-12+2+6.531mg·L、4.127mg·L和2.664mg·L。经过计算的到Cu和Zn对缢蛏的安全-1-12+2+浓度分别为：0.004mg·L、0.226mg·L，说明Cu对缢蛏的毒性远大于Zn。此2+2+外，还初步探讨了Cu和Z