运输对夏南牛外周血淋巴细胞hsps基因表达的影响及hsp70基因的克隆

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1、河南农业大学硕士学位论文运输对夏南牛外周血淋巴细胞HSPs基因表达的影响及HSP70基因的克隆姓名：杨高丰申请学位级别：硕士专业：临床兽医学指导教师：邓立新201205河南农业大学2012届硕士学位论文摘要应澈是机体受到应激性刺激后所产生的一种非特异性反应，畜禽养殖业的发展以及国内外畜禽贸易的繁荣，畜禽运输成为畜牧业中的必要环节。本试验随机选择相同环境中饲养的6头夏南牛(8)，用牛用动物运输车进行运输应激，运输时问为运输前lh、运输前Oh；运输盈、3h、鳙、l饰、15lI、20h；运输后10h、20h、30h。道路包括城市道路、国道、高速的混台路，速度控制在60-70kmP

2、a，整个运输过程没有饮水和喂食。对试验肉牛进行及时采取斑渡，分离趣清、做浆、淋巴细胞，分离的血清和血浆予-20"C保存，分别用于皮质簿(Cox)和促肾上激素(禽嗍)的检测。分离淋巴细胞子罐0℃保存，通过RT-PCR克摩了肉牛外周衄淋巴缬艴中受运输胁迫诱导基因，用于热应澈蛋白(HSP毽)酶联免疫反应检测和对应mRNA在不同运输对闯阶段的表达特性。从而探讨阿牛在长途运输过程中热应激蛋白(HSPs)表达及其对应的mRNA转录规律，及其它们之间的相关性。利用R嗍方法克隆了1个肉牛运输胁迫诱导基因；HSP70，其基因克隆片段长度为985bp。BLASTX搜索结果显示，克隆基因编码的核

3、苷酸序列与多个动物中的热激蛋白Hsp70同灏性很高，其中与牛的AY662497．1、绵羊的EFl97836．1和野猪的NM213766．i序列同源性分别高达99％、99％和97％。利用放射免疫法对激素水平进行分析，研究长途运输应激对肉牛激素水平的影响。结果表明，试验牛盥清皮质醇(CoD在运输前较低，在运输10h、15h和20h极显著增加(p《o．01)，运输到达后慢慢恢复到正常水平。在运输前试验牛血浆中促肾上腺皮质激素(枷)较低，运输3h时极显著升高(P

4、RNA转录水平，结果证明，试验牛的外周血淋巴细胞的HsP7锄lRNA的转录水平在运输3h、9h显著增加(P<0．05)，随后表达恢复到运输前水平；HSP27mRNA转录水平在运输3h显著升高(P<0．05)；HSP90mRNA转录水平仅在运后10h开始升高，并在运后20h极显著升高(P<0．01)，达到最大值。商业化试剂盒ELISA测定运输应激肉牛外周血淋巴细胞中的HSP70、HSP27和HSp90的水平。通过标准曲线法完成样品定量，用B吨e曲控制蛋白提取过程中出现的误差。结果显示，试验牛的外周血淋巴细胞的HSPT0在运输2lI、3h、％的表达极显著增加(P

5、后表达恢复到运输前的水平，HSP27的表达与HSPT0的趋势相似，HSP27在运输弛极显著增加(P<0∞1)，随后降低并恢复到运前水平，HSP90在运输9ll表达极显著升高僻

6、date：YangGaofeng／山str80r=Stressisammspec主f配托印舶sewhichisgeneratedbystressfulstimuli，thedevelopmentoflivcs蛾andpoultrybreedingindustry,andtheprosperityofLivestockTradeathomeand曲嘲livestock馏啪洲hasbecometheessentiallinkintheanimalhmbandry．The翻印啜i由删randomlychoose6headYdaNanniu(各)which嘴raisedinthes

7、ameenvironment，withbovineanimal嘲恻vehiclestOtransportstress，transportationtimeforbefore㈣tionlh，0h；transportation2h，3h，勉，10h，15h，20h；aRertransportation10h，20h，30h。Thel!o耐ism奴edroad／ncludingCityRoad、StateRoad、high删，speedcantrolin60-70kin／h，thetransportation稍thout