羊传染性脓疱病毒的分离鉴定及其保护性抗原基因重组山羊痘病毒载体的构建

《羊传染性脓疱病毒的分离鉴定及其保护性抗原基因重组山羊痘病毒载体的构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、分类号：密级：学号：2009108037单位代码：10759石河子大学硕士学位论文羊传染性脓疱病毒的分离鉴定及其保护性抗原基因重组山羊痘病毒载体的构建学位申请人李瑞芳指导教师陈创夫教授申请学位类别农学硕士专业名称预防兽医学研究领域畜禽病原分子生物学所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2012年6月IsolationandidentificationofOrfvirusandConstructionofrecombinantGoatpoxvirusexpressingpretectiveantigengeneofOrfvirusADissertationSubmitte

2、dtoShiheziUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementsFortheDegreeofMasterofAgricultureByLiRuifang(PreventiveVeterinaryMedicine)DissertationSupervisor:Prof.ChenChuangfuJune,2012石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经发表或撰写过的研究成果。

3、对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。研究生签名：时间：年月日使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日羊传染性脓疱病毒的分离鉴定及其保护性抗原基因重组山羊痘病毒载体的构建摘要羊传染性脓疱病是由羊传染性脓疱病毒（ORFV）引起绵羊

4、、山羊等中小反刍动物及人的一种急性、高度嗜上皮性、接触性传染病。该病在世界各养羊业国家和地区广泛流行，对养羊业的危害较大，经济损失严重。目前尚无有效的药物用于该病的治疗，疫苗接种被认为是控制该病流行可靠而有效的手段。常规的弱毒苗和灭活苗在预防该病的发生和流行过程中起到了一定的作用，能在一定程度上降低感染率，但存在病毒毒力返强，活病毒逃逸及病毒变异株的出现等不安全因素，导致疫苗的免疫保护率不高。因此，有必要应用基因工程手段开发一种新型的疫苗候选株，以更好的预防该病的发生和流行。对采集新疆地区疑似羊传染性脓疱病的羔羊结痂病料，用MDBK传代细胞进行病毒分离培养及电镜观察，然

5、后进行动物回归实验，对特异性目的基因进行PCR扩增，并将其克隆至pMD18-T载体中进行测序和序列分析及遗传进化树构建；根据GenBank公布的ORFVB2L基因的核苷酸序列，利用PrimerPremier5.0软件分析设计引物，使用PCR技术从提取的质粒中扩增B2L基因，构建原核表达载体，将其转化至大肠埃希菌BL21中，经IPTG诱导，用SDS-PAGE及Westernblot检测目的蛋白的表达情况及其反应原性；采用筛选出的GTPV自身56bp双向启动子，通过分子克隆技术构建重组山羊痘穿梭载体；以同样的方法选取P11和P7.5启动子，构建对照载体；将构建好的重组山羊痘

6、穿梭载体，通过脂质体转染BHK-21细胞；利用X-gal筛选收获的转染产物，对筛选出的蓝色蚀斑进行连续扩增和传代，直至得到较纯的重组山羊痘病毒；利用PCR技术、RT-PCR技术检测经纯化后得到的重组山羊痘病毒。接种病毒后MDBK传代细胞出现了细胞病变，实验动物的羊只出现了典型的羊传染性脓疱病的临床症状，电镜观察到病毒粒子；PCR扩增出B2L基因长1137bp，F1L基因长1023bp，B2L基因序列分析表明该分离株与其它毒株间核苷酸和氨基酸的同源性分别为97.63%~99.91%和97.35%~100%，而F1L基因序列分析表明与其它毒株间核苷酸和氨基酸的同源性分别为9

7、5.60%~99.61%和95.59%~99.71%。系统发育进化树结果表明，该分离株B2L基因与印度分离株India67/04的亲缘关系最近，而F1L基因与意大利分离株OV/C2的亲缘关系最近；说明成功分离到了羊传染性脓疱病毒，将其命名为ORFV-shz分离株；构建了B2L基因原核表达载体pET-32a-B2L，SDS-PAGE分析表明获得了约60kDa的融合蛋白；Westernblot检测其具有良好的反应原性；经测序鉴定正向连接的阳性克隆穿梭载体，命名为pUC-TK12-LacZ-Pb56-B2L和pUC-TK12-LacZ-Pb56