山羊痘病毒、羊传染性脓疮病毒的检测

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1、ICS11.220B41DB45广西壮族自治区地方标准DB45/TXXXXX—2011山羊痘病毒、羊传染性脓疮病毒的检测山羊痘病毒、羊传染性脓疮病毒的检测二重聚合酶链反应法DetectionofgoatpoxvirusandOrfvirusbyduplexPCR点击此处添加与国际标准一致性程度的标识（本稿完成日期：2010年12月7日）2011-XX-XX发布2011-XX-XX实施广西壮族自治区质量技术监督局发布DB45/TXXXXX—2011目次前言II1　范围12　术语和定义13　试验材料23.

2、1　用于GTPV和ORFV鉴别检测的特异性引物23.2　试剂23.3　仪器设备及耗材34　操作方法34.1　待检样品的准备34.2　待检样品总DNA抽提44.3　PCR扩增45　PCR检测结果判断45.1　电泳45.2　结果判定5附录A（资料性附录）　试剂盒6附录B（规范性附录）　溶液的配制7附录C（资料性附录）　溴化乙锭溶液的净化处理注意事项10附录D（规范性附录）　溴化乙锭溶液的净化处理11附录E（规范性附录）　1％琼脂糖凝胶的制备12附录F（规范性附录）　检测结果凝胶电泳图示1313DB45/T

3、XXXXX—2011前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由广西壮族自治区水产畜牧兽医局提出。本标准起草单位：广西壮族自治区动物疫病预防控制中心。本标准主要起草人：郑敏、施开创、胡杰、刘棋、李军、陈义祥、陆文俊、莫胜兰、梁媛、屈素洁。本标准为首次发布。13DB45/TXXXXX—2011标准名称1　范围本标准规定了应用二重聚合酶链式反应技术检测山羊痘病毒和羊传染性脓疮病毒的材料准备、操作方法及结果判定方法。本标准适用于山羊痘和羊传染性脓疮的快速鉴别诊断，可对病羊临床组织样品及病毒

4、细胞分离培养物进行检测。2　术语和定义下列术语和定义适用于本标准。2.1　山羊痘goatpox是由山羊痘病毒（Goatpoxvirus,GTPV）引起山羊的一种高度接触性传染病，以发热、全身痘疮、结节和死亡为特征。由于该病可造成严重的经济损失、阻碍国际贸易，被世界动物卫生组织（OIE）列为需报告的传染病，我国农业部将其列为一类动物疫病。山羊痘病毒（GTPV）是痘病毒科（Poxviridae）羊痘病毒属（Capripoxvirus）成员，是一种有囊膜的DNA病毒。2.2　羊传染性脓疮contagious

5、ecthyma俗称羊口疮，是由羊传染性脓疮病毒（Orfvirus,ORFV）引起的一种高度接触性传染病，侵害绵羊、山羊和野生反刍兽，表现为口唇等处皮肤和粘膜形成丘疹、脓疮、溃疡和结成疣状厚痂，主要通过圈舍、用具或皮肤擦伤传播，呈群发性。该病呈全世界广泛流行，我国农业部将其列为三类动物疫病。羊传染性脓疮病毒（ORFV）是痘病毒科（Poxviridae）副痘病毒属（Parapoxvirus）成员，是一种有囊膜的DNA病毒。2.3　聚合酶链式反应polymerasechainreaction,PCRPCR技

6、术是一种在体外快速扩增特定DNA片段的方法。由热变性→复性→延伸三步反应组成一个PCR循环，经过多次循环反应，使目的DNA得以大量扩增。2.4　二重聚合酶链式反应duplexpolymerasechainreaction13DB45/TXXXXX—2011是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种新型DNA扩增技术，在同一反应体系中同时加入两对引物扩增两条目的基因。采用这一技术可同时检测两种病原微生物。1.1　引物primer与待扩增DNA片段两端互补的一段寡核苷酸。1.2　特异性引物specificp

7、rimer针对特定模板DNA片段设计的一段互补寡核苷酸，在PCR反应中与模板DNA特异性结合。2　试验材料2.1　用于GTPV和ORFV鉴别检测的特异性引物根据GTPV和ORFV的基因组特性和差异，在GTPV的A29L基因保守序列设计合成了1对寡核苷酸引物GTPV1/GTPV2，在ORFV的H3L基因保守序列设计合成了1对寡核苷酸引物ORFV1/ORFV2，扩增片段大小分别为413bp和708bp，两对引物的使用浓度均为25mmol/L。2.2　试剂2.2.1　抽提试剂DNA抽提试剂如下：——DNA抽

8、提试剂：平衡酚：氯仿：异戊醇按体积分数分别为25:24:1比例混合；——10％SDS；——20mg/mL蛋白酶K；——异丙醇；——75％乙醇。注：商品信息见附录A。2.2.2　PCR试剂PCR试剂如下：——TaqDNA聚合酶；——dNTPs混合物：包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP；——MgCl2；——PCR缓冲液。注：商品信息见附录A。2.2.3　电泳试剂电泳试剂如下：——1％琼脂糖；——10mg/mL溴化乙锭；——凝胶加样缓冲液；13DB45