基于细胞电融合技术的体细胞重编程研究

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1、第三军医大学博士学位论文基于细胞电融合技术的体细胞重编程研究姓名：屈娅申请学位级别：博士专业：眼科学指导教师：阴正勤201205第三军医大学博士学位论文基于细胞电融合技术的体细胞重编程研究+摘要背景：由成体细胞获得多能干细胞是替代胚胎干细胞治疗相关疾病的有效手段之一，主要通过体细胞核移植技术、特定基因导入和细胞融合获得。体细胞核移植技术因其极低的成功率及克隆动物普遍存在的早衰、早天现象阻碍了该技术的推广运用，随之引发的治疗性克隆和生殖性克隆亦导致不可避免的伦理学争议。导入特定基因的方法研究中，作为载体的慢病毒可能改写染色体的遗传信息，某些转录因子可能诱发癌症，也具有一定程度的局限性。细

2、胞融合是一项迅速发展的新兴细胞工程方法，该方法通过介导和培养，在离体条件下用人工方法将两个或者多个细胞通过无性方式融合(合并)成一个单核或多核的杂合细胞。2005年，Cowan等研究人员通过聚乙二醇将人成纤维细胞和胚胎干细胞融合后，杂合细胞所表现出的形态学、生长特性以及体内外分化能力同胚胎干细胞惊人的一致，该研究表明通过细胞融合可实现人成体细胞重编程。2009年，Voldman等利用微流控制技术精确地实现了高效率的细胞配对和融合，并将这种融合技术运用于小鼠胚胎干细胞和胚胎成纤维细胞，开拓了细胞电融合技术在体细胞重编程研究中的新前景。2010年1月，Blau领衔的研究小组同样采用聚乙二醇

3、融合了小鼠胚胎干细胞和人类成纤维细胞，这种异核体诱导的速度比正常的体细胞诱导速度快很多，仅需1天时间，诱导效率高达70％。上述研究表明细胞融合技术是实现体细胞重编程研究的潜在有效手段，该技术的优点在于：一是可以避免传统的胚胎干细胞治疗所带来的伦理学争议和免疫排斥反应等问题；二是可以有效避免其他体细胞重编程技术的缺点，成为研究重编程机制的重要方法。目的：采用与重庆大学生物工程学院联合设计研发的“基于微流控制技术和低压脉冲电融合技术”的高效细胞电融合芯片，进行小鼠成体细胞和胚胎干细胞的电融合实验，研究所得到的融合细胞的生物学特性、体内外分化潜能以及DNA去甲基化状态等，确定融合细胞是否发生

4、了体细胞重编程，成为多潜能干细胞，并观察融合细胞在视网膜变性微环境下的分化命运。方法及结果：本研究分为四个部分：+国家重点基础研究发展计划(973)课题资助项目(2007CB512203)7第三军医大学博士学位论文第一部分高通量细胞电融合实验平台及其研究1、采用“视觉损伤与再生修复重庆市重点实验室”(以下简称本实验室)设计研发的交错式微电极阵列芯片，构建细胞电融合实验平台。脉冲梯度实验观察脉冲电压对细胞活性的影响后发现，当脉冲电压的幅度≥10V，细胞会因为细胞膜产生不可逆电穿孔而死亡，8V一9V的脉冲电压是细胞膜穿孔最充分，而又不会导致高细胞死亡率的最佳融合电压。2、采用HEK293细

5、胞、NIH3T3细胞及mESC细胞分别实现了同种细胞的排队及电融合；分别转染带不同荧光的病毒，实现异种细胞的排队及电融合实验；在此基础上计算其排队率及融合率，同种细胞两两排队平均率为41％左右，异源细胞两两平均排队率为35％左右；同种细胞排队后的平均融合率为46％左右。异源细胞排队后平均融合率可以达到59％，实现了高效率／高通量细胞电融合。3、采用细胞核型分析对单细胞及融合细胞的染色体数目进行统计分析，NIH3T3细胞染色体数目主要集中在68条，HEK293细胞主要集中在72条，mESC细胞染色体数目为40条。对于融合细胞染色体来说，NIH3T3和HEK293细胞融合后染色体集中在14

6、0条左右，为两亲本染色体数目之和。mESC和NIH3T3细胞融合后染色体数目集中在108条左右，为两亲本细胞染色体数目之和。第二部分小鼠成体细胞与胚胎干细胞电融合后的多潜能干细胞研究1、将pZLENU—tagRFP慢病毒成功转染NIH3T3细胞，采用流式细胞仪分选纯化，稳定传代。与带GFP的小鼠胚胎干细胞电融合后，利用融合细胞具有双荧光的特性进行FACS分选并收集，得到的融合细胞后采用干细胞培养体系进行培养，形成类似于胚胎干细胞克隆。2、免疫荧光组化方法发现，融合细胞同时表达Oct4、Nanog、Sox2三种与细胞全能性相关的多潜能标志性基因。体外分化试验中能够采用悬滴培养法获得拟胚体

7、，具有亲本细胞的双荧光特性。体内分化试验中采用裸鼠皮下注射方法，1月后在裸鼠皮下形成畸胎瘤，包膜完整，瘤体相对于胚胎干细胞对照组明显偏大，但两者不存在统计学差异；瘤体具有双荧光表达，可见外胚层来源的原始神经管、鳞状上皮，中胚层来源的脂肪组织、软骨组织，以及内胚层来源的柱状上皮、杯状上皮，形态典型。石蜡免疫组化检测外胚层巢蛋白标记物Nestin、中胚层结蛋白标记物Desmin、内胚层GATA6三种三胚层标志物均为阳性表达。8第三军医大学博士学位论