三黄鸡体细胞重编程及ipsc培养体系的优化

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3、明本人声明所呈交的论文，是本人在导师的指导下独立进行研究所取得。的研究成果除已特别加标注和致谢的地方外，论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的研究成果，也不包含本人或他人为获得广西大学或其它单位的学位而使用过的材料一。与我同工作的同事对本论文的研巧工作所做的贡献均己在论文中作了明确说明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相关的职务作品，知识产权归属广西大学。本人授权广西大学拥有学位论文的部分使用权，目Ｐ；学校有权保存并向国家有关部口或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许论レ文被查阅和借阅，可ッ将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进

4、行检索和传播，可レッ采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本学位论文属于：□保密，在年解密后适用授权。保密。＂＂请在上相应方框内巧Ｖ（）、论文作者签名？占：句日期：指导教师签名日期５Ｗ７：作者联系电话；ｉｒ子嶋Ｈ黄鸡体细胞重编程及ｉＰＳＣ培养体系的优化摘要诱导多能干细胞（Ｉｎｄｕｃｅｄｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔｓｔｅｍｃｅｌｌ，巧ＳＣ）是通过将外源多能因子导入到已分化的细胞中，促进多能基因表达，使细胞重编程而获得一ｏｎ多能性的类细胞。巧ＳＣ与ＥＳＣ（ＥｍｂｒｙｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌ）类似，具有分化成各种类型

5、细胞和Ｈ个化层的潜能。相比分离胚胎干细胞牺牲脏胎的局限ｉ性，ＰＳ技术可诱导多种来源的细胞，给研究人员提供了更多的研究材料，并规避了破坏胚胎等伦理问题。巧ＳＣ技术应用在禽类物种上，可Ｗ促进珍稀鸟类和优良种禽的保种育种。本论文研究主要从广西兰黄鸡体细胞出发一诱导；？５。并优化１？５（：的培养系统，为建立套＾＾干细胞为基础的家禽保。种育种平台奠定基础研究主要分为Ｈ部分，分别为分离Ｈ黄鸡体细胞、诱导重编程王黄鸡脏成纤维细胞、鸡ｉＰＳＣ的培养条件的优化，结果如下；（１）Ｈ黄鸡体细胞分离。本实验分离Ｈ黄鸡幼鸡羽毛细胞，采用不同种类培养液、膀蛋白酶不同时间消

6、化、不同浓度血清培养液分离培养羽毛细胞。发现膜蛋白酶消化１０分钟，ＤＭＥＭ／Ｆ１２培养液培养可＾＾分离到羽毛细胞，但羽毛细胞传代后增殖速度减慢趋向死ｔ。分离并得到Ｈ黄鸡幼鸡必、肝、肌肉组织、鸡胚成纤维细胞。（２）Ｈ黄鸡胚成纤维细胞诱导重编程。采用含有０ｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、－Ｌｉｎ２８、ｃＭｃ多能转录因子Ｐｉｂａｃ转座子脂质体法转染ＣＥＦ细胞，转染ｙｇｇｙ培养。１０天后没有出现细胞克隆使用含有不同Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、Ｉ－－ＭＫｃｃ和ｌｆ４多能因子组合的慢病毒载体感染Ｃ邸细胞，发现Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、ｙＯｃ－－

7、ｔ４、ＮａｎｏＭｃ、Ｋ＿ｌｆ４组合均可实现ｇ组合，Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ４、ｃｙ细胞重编程，诱导出碱性憐酸酶阳性克隆。（３）鸡巧ＳＣ的培养系统的优化。通过配制不同营养成分的培养液，改变培养液中添加ＢＲＬ条件培养液比例、ＦＧＦ浓度、ＬＩＦ浓度，对比ＢＲＬ、ＳＴＯ、Ｍ即饲养层，对比昆明小鼠和１Ｃ民小鼠ＭＥＦ饲养层，对比丝裂霉素Ｃ处理和物理福射处理ＭＥＦ饲养层，培养并观察鸡巧ＳＣ的生长状态。实验结果发现１Ｃ民小鼠ＭＥＦ细胞经丝裂霉素Ｃ处理制备饲养层适合鸡ｉＰＳＣ生长，１Ｃ民小