溶血磷脂酰胆碱对心肌细胞t型钙离子通道的影响

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1、河北医科大学硕士学位论文溶血磷脂酰胆碱对心肌细胞T型钙离子通道的影响姓名：王晓宇申请学位级别：硕士专业：内科学指导教师：刘刚；郑明奇201203中文摘要溶血磷脂酰胆碱对心肌细胞T型钙离子通道的影响摘要目的：溶血磷脂酰胆碱(1ysophosphatidylcholine，LPC)是氧化型低密度脂蛋白(oxidizedlowdensitylipoprotein，OX．LDL)的主要活性成分，具有广泛的生物学效应。作为～种两性磷脂，在血浆中的正常浓度范围是12-166洋nol／L。虽然在生理状态下心肌细胞中溶血磷脂酰胆碱的含量较少，但在心肌缺血状态下，由于磷脂酶A2的激活l¨

2、，可以在心肌细胞胞内和／或细胞间隙中增加，其作为细胞膜溶解的毒性产物，具有很强的致心律失常作用。心肌细胞膜上分布有T型和L型钙通道的两种钙离子通道类型，其中T型钙离子通道在心脏自律性、心血管的重塑和细胞的生长中所发挥了很大的作用。通过研究溶血磷脂酰胆碱对心肌细胞T型钙通道电流(Ica'r)的影响，阐明心肌细胞内和／或细胞间隙中溶血磷脂酰胆碱的增加引起心律失常的内在信号调控机制。方法：l制备l。3天薪生Wistar大鼠心室胍细胞。2人类心脏T型钙通道的alH(Cav3．1)glalG(Cav3．2)亚基在HEK293细胞中稳定表达。3大鼠心室肌细胞的分离。采用Langen

3、dorff-主动脉逆行灌注消化酶溶液方法来进行对大鼠心室肌细胞的分离，其基本原理是依靠心脏的搏动来排出心脏内的积血，避免冠脉血管栓塞或污染，然后再用各种消化酶液进行其细胞分离。通过两步酶消化方法共得三份不同酶解时间的细胞悬液(约50ml／份)。心室心肌细胞将培养在DMEM培养基(Sigma)，在37℃孵育箱放置备用。4使用全细胞膜片钳技术测定新生大鼠心室肌细胞和异源稳定表达alG和alH亚基的HEK．293细胞(HEK．293／alG和HEK。293／alH)中的Cav3。l幂l：ICav3。2T型钙离子通道，进而研究溶血磷脂酰胆碱调控Ic耵的内在信号机制。5玻璃微电极

4、的制作和细胞封接与全细胞记录模式的形成。玻璃微电极经玻璃微电极拉制器两步拉制而成，充以电极内液后微电极入水后阻抗、中文摘要为2～6MQ。应选择纹理清晰、边缘整齐、表面光滑、两端棱角分明的心室肌细胞进行封接，封接过程利用三维微操纵器移动玻璃微电极，将其移动至细胞的中间位置，轻压在被选细胞表面，防止细胞出现漂移，略施负压持续吸引即可形成1GQ水平以上的高阻抗封接，对电极电容补偿后再用较大脉冲式负压吸破细胞膜，形成全细胞记录形式(wholecellprotoc01)状态，并通过调节慢电容、快电容补偿和电极串联电阻补偿以减少瞬时充放电电流和钳位误差。剂量效应曲线由下述方程获得：

5、Fraction=齐lj量／效应比=Imin+(Im默一Imin)／{l+([C]／EC50)h)。其中Imin为最dqCaT值，Im．x为溶血磷脂酰胆碱处理后最大IcaT值，【C】为溶血磷脂酰胆碱浓度，ECso为溶血磷脂酰胆碱所致I∞的半效应浓度，h为斜率。结果：‘l溶血磷脂酰胆碱显著提高了新生大鼠心室肌细胞的自律性和Ica．To经溶血磷脂酰胆碱(10}tM)处理后，新生鼠心肌细胞搏动从40士6次／分增至61士7次／分；同时最大Ic钆T增加了20．4％。2在异源稳定表达0L1G和伐1H亚基的HEK293细胞，溶血磷脂酰胆碱(10}tM)对Ica。3．1无显著影响(37

6、．3士2．5vs39．5士3．1pA／pF，n=26)，甚至溶血磷脂酰胆碱浓度增至501aM也没有明显增大Icav3．1；但溶血磷脂酰胆碱(10}tM)显著增加了Ic鲥3．2(36．7+2．2vs42．3+3．0pA／pF，n=39)，溶血磷脂酰胆碱浓度增至50ktM时最大ICar3．2增为47．5士3．8pA／pF(n=23)。3HEK．293／QlH细胞用蛋白激酶抑制剂预处理lh后，进行全细胞电压钳研究观察溶血磷脂酰胆碱对Ic也T的作用。结果显示PKA抑制剂(H89，101xM)，PKG抑制剂(KT5823，l}tM)，钙调蛋白激酶II抑制剂(KN．62，31aM)

7、和胞外信号调节激酶l／2抑制剂(PD98059，10pM)均未显著影响溶血磷脂酰胆碱对Ic乱水lH的增大作用。然而，PKC抑制剂(白屈菜红碱，5I_tM)则显著减弱了溶血磷脂酰胆碱对Ic扎T(alH)的作用。这些结果提示PKC途径的激活可能介导了溶血磷脂酰胆碱引起的ICav3．2升高。用蛋白激酶PKCa特异性抑制剂(Ro．32．0432；30nM)预处理后，完全阻断了溶血磷脂酰胆碱引起的Icav3．2的增加(35．8士1．9vs37．1-4-2．0pA／pF，n=21)。但在相同培养条件下，PKCBI特异性抑制剂G66976和PKC[BI