稳定表达靶向hsv2 vp16 shrna重组细胞系的建立及其对hsv2复制能力影响研究

《稳定表达靶向hsv2 vp16 shrna重组细胞系的建立及其对hsv2复制能力影响研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、郑州大学博士学位论文稳定表达靶向HSV2VP16shRNA重组细胞系的建立及其对HSV2复制能力影响研究姓名：张锐申请学位级别：博士专业：神经病学指导教师：许予明；韩志强201203摘要稳定表达靶向HSV2VPl6shRNA重组细胞系的建立及其对HSV2复制能力影响研究博士研究生：张锐导师：许予明韩志强郑州大学第一附属医院神经内科河南郑州450052摘要背景：单纯疱疹病毒2型(HSV2)是单纯疱疹病毒的一个亚型，为人类易感病毒，是严重威胁人类健康的常见病原体之一。它不仅可引起生殖系统感染，还可导致严重的非典型性疾病及神经系统疾病，如新生儿致命性脉络膜炎

2、，脑膜脑炎及成人脑膜炎。HSV2还可增加患者对人类缺陷型病毒的易感性。VPl6即包膜蛋白的一种，由晚期基因UL48编码。VPi6在病毒复制周期的晚期表达，启动HSV基因的级联转录反应。作为多功能病毒蛋白，VP]6不仅是病毒裂解性感染的主要因子，在病毒从潜伏期重新激活过程中也起关键作用。在裂解期，VP]6可传送至下一个宿主细胞并通过聚集VPl6诱导复合体激活立早期基因的转录。RNA干扰(RNAi)是多数真核细胞用双链RNA分子(dsRNA)特异性调节基因活动性的一种调节机制。目前应用的RNAi技术包括两种基本策略。一种以RNA为基础，应用化学合成的siR

3、NA；另一种以DNA为基础，构建携带shRNA的载体，从而构建稳定表达siRNA的细胞系。与化学合成的siRNA相比，后一种可长时间沉默基因表达。目的：本研究旨在应用以DNA为基础的RNAi技术，建立稳定表达靶向HSV2VPl6shRNA的veFo—shRNA细胞系。并研究其对VPl6表达的抑制能力，及VPl6表达下调对HSV2复制能力的影响。方法：摘要首先，构建携带靶向HSV2VPl6基因shRNA的慢病毒载体质粒plko-shRNA。经PCR及测序鉴定正确后，与慢病毒辅助蛋白质粒△8．2和慢病毒包膜蛋白质粒VSV-G共转染慢病毒宿主细胞293T细胞

4、。48小时以后，收集培养皿中培养液，用O．45Ilm滤膜孔径的一次性针头滤器过滤，即可获得病毒原液。病毒原液于25000rpm4℃超速离心90分钟以后，弃掉上清液，用lmlPBS重悬，即可得病毒浓缩液。测病毒滴度后，复苏vero细胞，等到细胞长至70％时，于其中四孔加入重组慢病毒virus—plko-shRNA，剩下的两孔中加等量的无菌PBS，以作为阴性对照。细胞经过8lag／ml嘌呤霉素抗性筛选，挑选同时表达绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)的单细胞克隆继续扩大培养。即建成vero-shRNA24，vero—shR

5、NA642与shRNA阴性对照vero-shCON细胞系。细胞分组情况如下：A．-Vero，B：Vero—shCON，C：Vero—shRNA24，D-Vero—shRNA642，E：Vero—shRNA24+642。HSV2感染各组细胞后，应用实时荧光定量PCR检测，根据Ct值计算VPl6mRNA相对表达量和shRNA抑制率。用同样的方法分别测定第10，20与50代子细胞系对HSV2VPl6的抑制率。HSV2病毒感染各vero—shRNA细胞系，24小时后观察各组细胞的CPE情况，通过计算每孔中病变细胞，即融合，挛缩，肿胀，脱壁及死亡细胞的比例，评估

6、细胞CPE率。为检测其对HSV2病毒复制能力的影响，感染HSV一2的各组细胞系分别于感染后24，48，72，84，96小时取样，病毒产量减少实验测定子代病毒滴度，并绘制病毒一步生长曲线。用同样的方法分别测定第10，20与50代子细胞系对HSV2子代病毒滴度的影响。结果：经测序鉴定，成功构建慢病毒载体plko—shRNA24，plko—shRNA642与plko-shCON。分别与慢病毒辅助蛋白质粒△8．2和慢病毒包膜蛋白质粒VSV—G共转染慢病毒宿主细胞293T细胞后，获得重组慢病毒。感染vero细胞后，经过三轮嘌呤霉素筛选与GFP表达阳性筛选，挑取嘌

7、呤霉素抗性，且GFP表达阳性的单细胞克隆，扩大培养，即成功构建vero-shRNAs细胞系，根据所表达shRNA不同，分别命名为vero-shRNA24，vero—shRNA642和阴性对照vero—shCON。检测时，一组将以vero-shRNA24和vero-shRNA642等比例混合培养，称为vero-shRNA24+642。首先，应用实时定量PCR检测vero-shRNAs对细胞内VPl6mRNA表达的抑制效率。以MOI=I的HSV2感染各组细胞后，与vero细胞相比，vero-shRNA24，vero—shRNA642和vero—shRNA2

8、4+642可明显减少VPI6mRNA的表达(P